Desenvolvimento de uma tira imunocromatográfica de fluxo lateral para detecção rápida e quantitativa de compostos de pequenas moléculas
Abstract
As tiras imunocromatográficas de fluxo lateral baseadas em membrana (ICSs) são ferramentas úteis para o autodiagnóstico de baixo custo e têm sido aplicadas eficientemente à toxina, ao índice fisiológico e à detecção de biomarcadores clínicos. Neste protocolo, fornecemos uma descrição detalhada das etapas para desenvolver um imunoensaio de fluxo lateral rápido, sensível e quantitativo (usando AuNPs como marcador e mAbs como uma sonda). O procedimento descreve a preparação e caracterização do ouro coloidal, síntese do conjugado AuNP-mAb, montagem da tira imunocromatográfica e investigação metodológica do ensaio. Os resultados mostraram que as tiras finais podem ser ainda mais utilizadas para o rápido e conveniente autodiagnóstico de uma pequena molécula, o que pode fornecer uma ferramenta alternativa na análise rápida e precisa dos índices fisiológicos e biológicos.
Introduction
As tiras imunocromatográficas de fluxo lateral baseadas em membrana (ICSs) são ferramentas úteis para detecção rápida e de baixo custo. A membrana de nitrocelulose como o portador e o ouro coloidal como marcadores de reagentes de diagnóstico rápido de cromatografia imune são o método POCT (teste de ponto de cuidado) mais usado, e o escopo de teste do projeto é mais amplo. A partir de sua aplicação original no monitoramento durante a gravidez, seu uso foi estendido para monitorar o estado de coagulação sanguínea1,2, lesão do miocárdio3, medicina veterinária4, resíduos de pesticidas5,doenças infecciosas6 e concentrações de medicamentos. Mais tipos de amostras podem ser avaliadas, incluindo urina, saliva, sangue inteiro, soro e outros fluidos corporais7,8,9.
Nos últimos anos, inúmeros novos ensaios foram desenvolvidos para detectar biomarcadores no diagnóstico de transtornos, incluindo HPLC, UPLC, LC-MS e ELISA, sensíveis e precisos, críveis e específicos. No entanto, esses métodos requerem instrumentação sofisticada, pré-processamento complexo e tratamentos demorados9. Assim, desenvolver uma estratégia de diagnóstico de ponto de cuidado mais rápida e conveniente para a detecção auto e em tempo real de compostos ativos medicinais é urgente10,11.
A popularidade dos ICSs, especialmente para testes comuns, é impulsionada pela facilidade de uso, pois não necessitam de profissionais ou configurações instrumentais elaboradas12. Em outras palavras, pessoas que não possuem treinamento especial podem operar tiras ou autotestes13. Os resultados do teste podem ser obtidos em 5 minutos, o que significa que pode ser usado para inspeções no local14. Além disso, de acordo com nossos cálculos, o custo das tiras poderia ser inferior a 1 RMB15,o que significa que os testes são baratos para promover16. Portanto, o ICS é um dispositivo descartável relativamente preciso, simples e barato. ICSs baseados em ouro coloidal17,18 também são aplicados na detecção rápida covid-19.
O princípio do ICS pode ser dividido em sanduíche ICS e ICS competitivo. Figura 1A é um diagrama esquemático do sanduíche ICS, que é usado principalmente para detectar substâncias macromoleculares como proteínas, incluindo marcadores tumorais, fatores inflamatórios e gonadotropina coriônica humana (HCG, antígeno da gravidez precoce). Neste método, anticorpos emparelhados direcionados a diferentes epítopos do antígeno são usados, e o anticorpo de captura é seco na membrana NC como uma linha de teste. O anticorpo rotulado é seco na almofada conjugada, e o anticorpo secundário é usado como linha de controle.
Figura 1B é um diagrama esquemático do ICS competitivo, que é usado principalmente para detectar pequenas substâncias moléculas (MWCO < 2000 Da). O antígeno de revestimento é fixado na membrana NC como uma linha de teste, e o anticorpo rotulado é seco na almofada conjugada. Durante a detecção, a amostra e o fluxo de anticorpos rotulados através da linha de detecção sob ação capilar, e o antígeno revestido liga competitivamente o antígeno livre na amostra e desenvolve uma cor vermelha na linha de detecção.
Recentemente, descrevemos o procedimento de geração de anticorpos monoclonais contra produtos naturais19. Neste trabalho, desenvolvemos um novo imunoensaio de fluxo lateral baseado no preparado anti-SSD mA20 para detecção rápida e no local. Os resultados indicam que o ensaio de imunocromatografia é uma ferramenta indispensável e conveniente para detectar compostos derivados de produtos naturais.
Figura 1 Diagrama esquemático do ensaio de imunocromatografia (A) Tiras de teste imunocromatomatográficas sanduíche. (B) Tiras de teste anti-cromatográficas imunes competitivas indiretas. Este número foi modificado a partir de Zhang et al., 201821. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste trabalho, apresentamos um protocolo para a preparação de mAbs contra pequenas moléculas derivadas de produtos naturais. As etapas essenciais e as questões que necessitam de atenção no procedimento foram delineadas, e demonstramos a utilidade deste protocolo usando como exemplo a pequena molécula SSD. Exemplos de espectros, imagens TEM, resultados quantitativos e investigações metodológicas são mostrados em dados representativos. Assim, demonstramos que a produção de ouro coloidal, a conjugação AuNP-m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos Fundos Especiais de Fundos De Pesquisa Fundamental de instituições de ensino superior filiadas aos departamentos centrais. Agradecemos o apoio da Equipe de Pesquisa Básica de Prescrição Clássica da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim.
Materials
| Chloroauric acid solution (HAuCl4) | Tianjin Fu Chen Chemical Reagents Factory | JY-SJ102 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| Filter paper | Sinopharm | H5072 | |
| Glass fibre membranes | Jieyi | XQ-Y6 | |
| goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| Nitrocellulose membranes | Millipore | millipore 180 | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG20000 | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Pipette 10mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25mL | FALCON | 357525 | |
| semi-rigid PVC sheets | Jieyi | JY-C104 | |
| Sodium citrate | Beijing Chemical Works | C1034 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Tris-HCl | Solarbio | 77-86-1 | |
| TWEEN 20 | Solarbio | 9005-64-5 |
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