स्पष्ट सिलिकॉन विंडोज के माध्यम से अनुदैर्ध्य इंट्रावाइटल इमेजिंग
Summary
ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट, सिलिकॉन खिड़कियों का उपयोग करके दीर्घकालिक इंट्रावाइटल इमेजिंग के लिए यहां एक दृष्टिकोण प्रस्तुत किया गया है जिसे सीधे ब्याज के ऊतक / अंग और त्वचा से चिपकाया जा सकता है। ये खिड़कियां वर्तमान में क्षेत्र में उपयोग किए जाने वाले अन्य लोगों की तुलना में सस्ती और अधिक बहुमुखी हैं, और सर्जिकल सम्मिलन जानवरों के लिए सीमित सूजन और संकट का कारण बनता है।
Abstract
Intravital माइक्रोस्कोपी (IVM) एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर सेल आंदोलन, विभाजन और मृत्यु के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है। शल्य चिकित्सा से डाली गई इमेजिंग खिड़कियों के माध्यम से आईवीएम विशेष रूप से शक्तिशाली है क्योंकि यह दिनों से लेकर हफ्तों तक एक ही ऊतक के अनुदैर्ध्य अवलोकन की अनुमति देता है। विशिष्ट इमेजिंग खिड़कियों में माउस की त्वचा पर टांके गए बायोकंपैटिबल धातु फ्रेम में एक ग्लास कवरस्लिप शामिल होता है। ये खिड़कियां चूहों के मुक्त आंदोलन में हस्तक्षेप कर सकती हैं, एक मजबूत भड़काऊ प्रतिक्रिया प्राप्त कर सकती हैं, और टूटे हुए कांच या फटे हुए टांके के कारण विफल हो सकती हैं, जिनमें से किसी को भी इच्छामृत्यु की आवश्यकता हो सकती है। इन मुद्दों को संबोधित करने के लिए, लंबे समय तक पेट के अंग और स्तन ग्रंथि इमेजिंग के लिए खिड़कियों को पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) की एक पतली फिल्म से विकसित किया गया था, जो पहले कपाल इमेजिंग खिड़कियों के लिए उपयोग किया जाने वाला एक ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट सिलिकॉन बहुलक था। इन खिड़कियों को सीधे ऊतकों से चिपकाया जा सकता है, जिससे सम्मिलन के लिए आवश्यक समय कम हो जाता है। पीडीएमएस लचीला है, समय के साथ चूहों में इसके स्थायित्व में योगदान देता है- 35 दिनों तक परीक्षण किया गया है। अनुदैर्ध्य इमेजिंग अलग-अलग सत्रों के दौरान एक ही ऊतक क्षेत्र की इमेजिंग है। एक स्टेनलेस स्टील ग्रिड को एक ही क्षेत्र को स्थानीयकृत करने के लिए खिड़कियों के भीतर एम्बेडेड किया गया था, जिससे गतिशील प्रक्रियाओं (जैसे स्तन ग्रंथि involution) के विज़ुअलाइज़ेशन को एक ही स्थान पर, दिनों के अलावा अनुमति मिलती है। इस सिलिकॉन विंडो ने समय के साथ सूक्ष्म-मेटास्टेसिस में विकसित होने वाली एकल प्रसारित कैंसर कोशिकाओं की निगरानी की भी अनुमति दी। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली सिलिकॉन खिड़कियां धातु-फ्रेम वाली कांच की खिड़कियों की तुलना में सम्मिलित करना आसान है और छविवाले ऊतकों की सीमित सूजन का कारण बनती हैं। इसके अलावा, एम्बेडेड ग्रिड बार-बार इमेजिंग सत्रों में एक ही ऊतक क्षेत्र के सीधे ट्रैकिंग की अनुमति देते हैं।
Introduction
Intravital माइक्रोस्कोपी (IVM), anesthetized जानवरों में ऊतकों की इमेजिंग, बरकरार ऊतकों में सेलुलर संकल्प पर शारीरिक और रोग संबंधी घटनाओं की गतिशीलता में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। इस तकनीक के अनुप्रयोग व्यापक रूप से भिन्न होते हैं, लेकिन आईवीएम कैंसर जीव विज्ञान के क्षेत्र में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ताकि यह स्पष्ट किया जा सके कि कैंसर कोशिकाएं ऊतकों और मेटास्टेसाइज़ पर कैसे आक्रमण करती हैं, आसपास के माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ बातचीत करती हैं, औरदवाओं का जवाब देती हैं 1,2,3। इसके अलावा, आईवीएम पूर्व विवो प्रोफाइलिंग दृष्टिकोण (जैसे, फ्लो साइटोमेट्री) के पूरक अंतर्दृष्टि प्रदान करके प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करने वाले जटिल तंत्रों की समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण रहा है। उदाहरण के लिए, इंट्रावाइटल इमेजिंग प्रयोगों ने प्रतिरक्षा कार्यों के बारे में विवरण का खुलासा किया है क्योंकि वे सेल माइग्रेशन और सेल-सेल संपर्क से संबंधित हैं और चोट या संक्रमण 4,5,6,7 के जवाब में स्पैटिओटेम्पोरल गतिशीलता को क्वांटिटेट करने के लिए एक मंच की पेशकश की है। इनमें से कई प्रक्रियाओं का अध्ययन हिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग के माध्यम से भी किया जा सकता है, लेकिन केवल आईवीएम गतिशील परिवर्तनों की ट्रैकिंग की अनुमति देता है। वास्तव में, जबकि एक हिस्टोलॉजिकल अनुभाग किसी दिए गए समय में ऊतक का एक स्नैपशॉट प्रदान करता है, इंट्रावाइटल इमेजिंग समय के साथ एक ही ऊतक के भीतर अंतरकोशिकीय और उपकोशिकीय घटनाओं को ट्रैक कर सकता है। विशेष रूप से, प्रतिदीप्ति लेबलिंग में प्रगति और आणविक पत्रकारों के विकास ने आणविक घटनाओं को सेलुलर व्यवहारों के साथ सहसंबद्ध होने की अनुमति दी है, जैसे प्रसार, मृत्यु, गतिशीलता, और अन्य कोशिकाओं या बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स के साथ बातचीत। अधिकांश आईवीएम तकनीकें प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी पर आधारित होती हैं, जो प्रकाश प्रकीर्णन के कारण, इमेजिंग गहरे ऊतकों को चुनौतीपूर्ण बनाती हैं। इसलिए, ब्याज के ऊतक को अक्सर आक्रामक और टर्मिनल प्रक्रिया के साथ शल्य चिकित्सा से उजागर करने की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, अंग साइट के आधार पर, ऊतक को कुछ से 40 घंटे 8 तक की अवधि के लिए लगातार चित्रित किया जा सकताहै। वैकल्पिक रूप से, एक स्थायी इमेजिंग विंडो का सर्जिकल सम्मिलन एक ही ऊतक की इमेजिंग को 7,9 सप्ताह तक दिनों की अवधि में क्रमिक रूप से अनुमति देता है।
नई इमेजिंग खिड़कियों के विकास को इंट्रावाइटल इमेजिंग दृष्टिकोण10 में और सुधार करने के लिए एक तकनीकी आवश्यकता के रूप में हाइलाइट किया गया है। प्रोटोटाइपिकल इंट्रावाइटल इमेजिंग विंडो एक धातु की अंगूठी है जिसमें एक ग्लास कवरस्लिप होता है जोटांके 11 के साथ त्वचा पर सुरक्षित होता है। मुक्त आंदोलन के साथ हस्तक्षेप, एक्सूडेट का संचय, और ग्लास कवरस्लिप को नुकसान इस तरह की खिड़कियों का उपयोग करने के साथ देखी जाने वाली आम समस्याएं हैं। इसके अलावा, प्रोटोटाइपिकल विंडो को विशेष उत्पादन की आवश्यकता होती है, और सर्जिकल प्रक्रिया को व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता हो सकती है। इन मुद्दों को संबोधित करने के लिए, polydimethylsiloxane (PDMS), एक सिलिकॉन बहुलक, जो पहले मस्तिष्क12 में दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए कपाल खिड़कियों में इस्तेमाल किया गया है, पेट के अंग और स्तन ग्रंथि इमेजिंग में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था। यहां, पीडीएमएस-आधारित सिलिकॉन खिड़कियों को उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रस्तुत की गई है, जिसमें एक ही ऊतक क्षेत्रों के दोहराए गए इमेजिंग के लिए स्थलों को प्रदान करने के लिए स्टेनलेस-स्टील ग्रिड के चारों ओर खिड़की को कैसे कास्ट किया जाए। इसके अलावा, पेट के अंगों या स्तन ग्रंथि पर खिड़की डालने के लिए एक सरल, सिलाई मुक्त सर्जिकल प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। यह नया दृष्टिकोण वर्तमान में उपयोग की जाने वाली इमेजिंग खिड़कियों के साथ कुछ सबसे आम मुद्दों को दूर करता है और अनुदैर्ध्य इंट्रावाइटल इमेजिंग की पहुंच को बढ़ाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इंट्रावाइटल इमेजिंग खिड़कियां सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर शारीरिक और पैथोलॉजिकल प्रक्रियाओं को सीधे विज़ुअलाइज़ करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं क्योंकि वे समय के साथ प्रकट होते हैं। कास्टिंग और चूहों ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम लेजर-कट स्टेनलेस स्टील ग्रिड को डिजाइन करने और अनुकूलित करने में उनकी सहायता के लिए रोब एफर्ट को धन्यवाद देते हैं। इस काम को CSHL कैंसर केंद्र (P30-CA045508) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) (1R01CA2374135 और 5P01CA013106-49) से एम.ई. के लिए धन द्वारा समर्थित किया गया था; CSHL और Northwell Health; थॉम्पसन परिवार फाउंडेशन; अमेरिका भर में तैरना; और सीएसएचएल को सिमंस फाउंडेशन से अनुदान। एमएस को राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान चिकित्सा वैज्ञानिक प्रशिक्षण कार्यक्रम प्रशिक्षण पुरस्कार (T32-GM008444) और पुरस्कार संख्या 1F30CA253993-01 के तहत एनआईएच के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था। L.M. एक जेम्स एस McDonnell फाउंडेशन पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप द्वारा समर्थित है. जेएमए एक कैंसर अनुसंधान संस्थान / इरविंगटन पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप (सीआरआई पुरस्कार # 3435) के प्राप्तकर्ता हैं। डीएटी अग्नाशय के कैंसर अनुसंधान और थॉम्पसन परिवार फाउंडेशन के लिए Lustgarten फाउंडेशन समर्पित प्रयोगशाला द्वारा समर्थित है। कार्टून Biorender.com के साथ बनाए गए थे।
Materials
| 3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape | 3M | 70200770819 | |
| Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software and sensors | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Antibody | Abcam | ab125212 | |
| Curity gauze sponges | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Two-part, 10:1 mixing ratio |
| Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro 3D printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Far Infrared Heated blanket | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji imaging processing package | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Gating system: | BIOPAC Systems Inc. | The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Module, C Series | DA100C | ||
| Dual Gating Sys small animal | DTU200 | ||
| MP160 for Windows – Analysis system | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V;015000 | ||
| Pressure Pad | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Absorbable gelatin sponge |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody | R&D Systems | AF3667 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP mice | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Servohydraulic material testing machine | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST probe | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. | ||
| Polylactic acid filament | Hatchbox | 1.75 mm diameter | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 wound clips | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Stainless steel grid | Fotofab | One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square. | |
| Surface Treated SterileTissue Culture Plates | Fisher Scientific | FB012929 | Lid used as curing surface for imaging windows |
| TriM Scope Multiphoton Microscope | LaVision BioTec | Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr |
|
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48404-453 |
References
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