التصوير الطولي داخل الحيوية من خلال نوافذ السيليكون الشفافة
Summary
يتم تقديم نهج هنا للتصوير داخل الحيوية على المدى الطويل باستخدام نوافذ سيليكون واضحة بصريا يمكن لصقها مباشرة على الأنسجة / العضو محل الاهتمام والجلد. هذه النوافذ أرخص وأكثر تنوعا من غيرها المستخدمة حاليا في هذا المجال ، ويسبب الإدخال الجراحي التهابا محدودا وضيقا للحيوانات.
Abstract
يتيح الفحص المجهري داخل الحيوية (IVM) تصور حركة الخلية وانقسامها وموتها بدقة خلية واحدة. IVM من خلال نوافذ التصوير التي يتم إدخالها جراحيا قوية بشكل خاص لأنها تسمح بالمراقبة الطولية لنفس الأنسجة على مدار أيام إلى أسابيع. تشتمل نوافذ التصوير النموذجية على غطاء زجاجي في إطار معدني متوافق حيويا يتم خياطته على جلد الماوس. يمكن أن تتداخل هذه النوافذ مع الحركة الحرة للفئران ، وتثير استجابة التهابية قوية ، وتفشل بسبب الزجاج المكسور أو الغرز الممزقة ، والتي قد يتطلب أي منها القتل الرحيم. لمعالجة هذه المشكلات ، تم تطوير نوافذ لتصوير أعضاء البطن والغدة الثديية على المدى الطويل من فيلم رقيق من polydimethylsiloxane (PDMS) ، وهو بوليمر سيليكون شفاف بصريا كان يستخدم سابقا لنوافذ التصوير في الجمجمة. يمكن لصق هذه النوافذ مباشرة على الأنسجة ، مما يقلل من الوقت اللازم للإدخال. يتميز نظام PDMS بالمرونة ، مما يساهم في متانته في الفئران بمرور الوقت – تم اختبار ما يصل إلى 35 يوما. التصوير الطولي هو تصوير لنفس منطقة الأنسجة خلال جلسات منفصلة. تم تضمين شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ داخل النوافذ لتوطين نفس المنطقة ، مما يسمح بتصور العمليات الديناميكية (مثل التفاف الغدة الثديية) في نفس المواقع ، بفارق أيام. سمحت نافذة السيليكون هذه أيضا بمراقبة الخلايا السرطانية المنتشرة المفردة التي تتطور إلى نقائل صغيرة بمرور الوقت. نوافذ السيليكون المستخدمة في هذه الدراسة أبسط في الإدخال من النوافذ الزجاجية ذات الإطار المعدني وتسبب التهابا محدودا في الأنسجة المصورة. علاوة على ذلك ، تسمح الشبكات المدمجة بالتتبع المباشر لنفس منطقة الأنسجة في جلسات التصوير المتكررة.
Introduction
يقدم الفحص المجهري داخل الحيوية (IVM) ، وهو تصوير الأنسجة في الحيوانات المخدرة ، نظرة ثاقبة على ديناميكيات الأحداث الفسيولوجية والمرضية بدقة خلوية في الأنسجة السليمة. تختلف تطبيقات هذه التقنية على نطاق واسع ، ولكن IVM كان له دور فعال في مجال بيولوجيا السرطان للمساعدة في توضيح كيفية غزو الخلايا السرطانية للأنسجة وانتشارها ، والتفاعل مع البيئة الدقيقة المحيطة ، والاستجابة للأدوية1،2،3. بالإضافة إلى ذلك ، كان IVM مفتاحا لتعزيز فهم الآليات المعقدة التي تحكم الاستجابات المناعية من خلال توفير رؤى مكملة لنهج التنميط خارج الجسم الحي (على سبيل المثال ، قياس التدفق الخلوي). على سبيل المثال ، كشفت تجارب التصوير داخل الحيوية عن تفاصيل حول وظائف المناعة من حيث صلتها بهجرة الخلايا والاتصال الخلوي الخلوي وقدمت منصة لتحديد الديناميكيات الزمانية المكانية استجابة للإصابة أو العدوى4،5،6،7. يمكن أيضا دراسة العديد من هذه العمليات من خلال التلطيخ النسيجي ، ولكن IVM فقط يسمح بتتبع التغييرات الديناميكية. في الواقع ، في حين أن القسم النسيجي يقدم لقطة للأنسجة في وقت معين ، يمكن للتصوير داخل الحيوية تتبع الأحداث بين الخلايا وتحت الخلايا داخل نفس النسيج بمرور الوقت. على وجه الخصوص ، سمح التقدم في وضع العلامات الفلورية وتطوير المراسلين الجزيئيين بربط الأحداث الجزيئية بالسلوكيات الخلوية ، مثل الانتشار والموت والحركة والتفاعل مع الخلايا الأخرى أو المصفوفة خارج الخلية. تعتمد معظم تقنيات IVM على الفحص المجهري الفلوري ، والذي بسبب تشتت الضوء ، يجعل تصوير الأنسجة العميقة أمرا صعبا. لذلك ، غالبا ما تحتاج الأنسجة المثيرة للاهتمام إلى التعرض جراحيا من خلال إجراء جراحي ونهائي في كثير من الأحيان. وبالتالي ، اعتمادا على موقع العضو ، يمكن تصوير الأنسجة بشكل مستمر لفترة تتراوح من عدد قليل إلى 40 ساعة8. بدلا من ذلك ، يسمح الإدخال الجراحي لنافذة تصوير دائمة بتصوير نفس الأنسجة بالتتابع على مدى فترة من الأيام إلى الأسابيع 7,9.
تم تسليط الضوء على تطوير نوافذ تصوير جديدة كحاجة تكنولوجية لزيادة تحسين أساليب التصوير داخل الحيوية10. نافذة التصوير النموذجية داخل الحيوية هي حلقة معدنية تحتوي على غطاء زجاجي مثبت على الجلد باستخدام خيوط11. التداخل مع حرية الحركة ، وتراكم الإفرازات ، وتلف الغطاء الزجاجي هي مشاكل شائعة شوهدت مع استخدام هذه النوافذ. علاوة على ذلك ، تتطلب النافذة النموذجية إنتاجا متخصصا ، ويمكن أن يتطلب الإجراء الجراحي تدريبا مكثفا. لمعالجة هذه القضايا ، تم تكييف polydimethylsiloxane (PDMS) ، وهو بوليمر سيليكون ، والذي تم استخدامه سابقا في نوافذ الجمجمة للتصوير طويل الأجل في الدماغ12 ، للاستخدام في تصوير أعضاء البطن والغدة الثديية. هنا ، يتم تقديم طريقة مفصلة لتوليد نوافذ السيليكون القائمة على PDMS ، بما في ذلك كيفية إلقاء النافذة حول شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ لتوفير معالم للتصوير المتكرر لنفس مناطق الأنسجة. علاوة على ذلك ، يتم وصف إجراء جراحي بسيط وخالي من الغرز لإدخال النافذة فوق أعضاء البطن أو الغدة الثديية. يتغلب هذا النهج الجديد على بعض المشكلات الأكثر شيوعا مع نوافذ التصوير المستخدمة حاليا ويزيد من إمكانية الوصول إلى التصوير الطولي داخل الحيوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعد نوافذ التصوير داخل الحيوية أدوات مهمة للتصور المباشر للعمليات الفسيولوجية والمرضية بدقة خلوية أثناء تكشفها بمرور الوقت. يتغلب الإجراء الجديد الموصوف لصب وإدخال نوافذ تصوير مرنة من السيليكون في الفئران على بعض المشكلات الأكثر شيوعا مع نوافذ التصوير المستخدمة حاليا (الإفرازات والكسر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر روب إيفرت على مساعدته في تصميم وتحسين شبكات الفولاذ المقاوم للصدأ المقطوعة بالليزر. تم دعم هذا العمل من قبل مركز السرطان CSHL (P30-CA045508) وأموال ل M.E. من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) (1R01CA2374135 و 5P01CA013106-49) ؛ CSHL ونورثويل هيلث; مؤسسة عائلة طومسون؛ السباحة في جميع أنحاء أمريكا. ومنحة من مؤسسة سيمونز إلى CSHL. تم دعم MS من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة جائزة تدريب العلماء الطبيين (T32-GM008444) والمعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة 1F30CA253993-01. L.M. مدعوم من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه من مؤسسة جيمس إس ماكدونيل. حصل J.M.A. على زمالة ما بعد الدكتوراه من معهد أبحاث السرطان / Irvington (جائزة CRI # 3435). يتم دعم D.A.T. من قبل مختبر مؤسسة لوستغارتن المخصص لأبحاث سرطان البنكرياس ومؤسسة عائلة طومسون. تم إنشاء الرسوم المتحركة مع Biorender.com.
Materials
| 3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape | 3M | 70200770819 | |
| Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software and sensors | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Antibody | Abcam | ab125212 | |
| Curity gauze sponges | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Two-part, 10:1 mixing ratio |
| Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro 3D printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Far Infrared Heated blanket | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji imaging processing package | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Gating system: | BIOPAC Systems Inc. | The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Module, C Series | DA100C | ||
| Dual Gating Sys small animal | DTU200 | ||
| MP160 for Windows – Analysis system | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V;015000 | ||
| Pressure Pad | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Absorbable gelatin sponge |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody | R&D Systems | AF3667 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP mice | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Servohydraulic material testing machine | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST probe | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. | ||
| Polylactic acid filament | Hatchbox | 1.75 mm diameter | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 wound clips | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Stainless steel grid | Fotofab | One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square. | |
| Surface Treated SterileTissue Culture Plates | Fisher Scientific | FB012929 | Lid used as curing surface for imaging windows |
| TriM Scope Multiphoton Microscope | LaVision BioTec | Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr |
|
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48404-453 |
References
- Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
- Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
- Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
- Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
- Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917 (2014).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Anderson, T. L. . Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).
- Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
