Langsgående intravital avbildning gjennom klare silikonvinduer
Summary
En tilnærming er her presentert for langsiktig intravital avbildning ved hjelp av optisk klare, silikonvinduer som kan limes direkte til vev / organ av interesse og huden. Disse vinduene er billigere og mer allsidige enn andre som for tiden brukes i feltet, og kirurgisk innsetting forårsaker begrenset betennelse og nød for dyrene.
Abstract
Intravital mikroskopi (IVM) muliggjør visualisering av cellebevegelse, divisjon og død ved encellet oppløsning. IVM gjennom kirurgisk innsatte bildevinduer er spesielt kraftig fordi det tillater langsgående observasjon av samme vev over dager til uker. Typiske bildevinduer består av en glassdekslelip i en biokompatibel metallramme som sutureres til musens hud. Disse vinduene kan forstyrre musenes frie bevegelse, fremkalle en sterk inflammatorisk respons, og mislykkes på grunn av knust glass eller revet suturer, hvorav noen kan nødvendiggjøre eutanasi. For å løse disse problemene ble vinduer for langsiktig abdominal organ og brystkjertelavbildning utviklet fra en tynn film av polydimetylsiloksan (PDMS), en optisk klar silikonpolymer som tidligere ble brukt til kranialavbildningsvinduer. Disse vinduene kan limes direkte til vevet, noe som reduserer tiden som trengs for innsetting. PDMS er fleksibel, noe som bidrar til holdbarheten hos mus over tid – opptil 35 dager er testet. Langsgående avbildning er avbildning av samme vevsområde under separate økter. Et rutenett i rustfritt stål ble innebygd i vinduene for å lokalisere samme region, slik at visualisering av dynamiske prosesser (som brystkjertelinvolusjon) på samme steder, dager fra hverandre. Dette silikonvinduet tillot også overvåking av enkeltforminderte kreftceller som utviklet seg til mikrometastaser over tid. Silikonvinduene som brukes i denne studien er enklere å sette inn enn metallrammede glassvinduer og forårsaker begrenset betennelse i det avbildede vevet. Videre tillater innebygde rutenett enkel sporing av samme vevsregion i gjentatte bildebehandlingsøkter.
Introduction
Intravital mikroskopi (IVM), avbildning av vev hos bedøvede dyr, gir innsikt i dynamikken i fysiologiske og patologiske hendelser ved cellulær oppløsning i intakt vev. Anvendelsene av denne teknikken varierer mye, men IVM har vært medvirkende i kreftbiologifeltet for å bidra til å belyse hvordan kreftceller invaderer vev og metastasererer, samhandler med det omkringliggende mikromiljøet og reagerer på legemidler 1,2,3. I tillegg har IVM vært nøkkelen til å fremme forståelsen av de komplekse mekanismene som styrer immunresponsen ved å gi innsikt komplementær til ex vivo profileringsmetoder (f.eks. strømningscytometri). For eksempel har intravitale bildebehandlingsforsøk avslørt detaljer om immunfunksjoner når de gjelder cellemigrasjon og cellecellekontakt og har tilbudt en plattform for å kvantisere romlig dynamikk som svar på skade eller infeksjon 4,5,6,7. Mange av disse prosessene kan også studeres gjennom histologisk farging, men bare IVM tillater sporing av dynamiske endringer. Faktisk, mens en histologisk seksjon tilbyr et øyeblikksbilde av vevet på et gitt tidspunkt, kan intravital avbildning spore intercellulære og subcellulære hendelser i samme vev over tid. Spesielt har fremgang i fluorescensmerking og utvikling av molekylære reportere gjort det mulig å korrelere molekylære hendelser med cellulær atferd, for eksempel spredning, død, motilitet og interaksjon med andre celler eller den ekstracellulære matrisen. De fleste IVM-teknikker er basert på fluorescensmikroskopi, som på grunn av lysspredning gjør avbildning av dypere vev utfordrende. Interessevevet må derfor ofte eksponeres kirurgisk med en ofte invasiv og terminal prosedyre. Således, avhengig av organstedet, kan vevet avbildes kontinuerlig i en periode som varierer fra noen få til 40 h8. Alternativt tillater kirurgisk innsetting av et permanent bildevindu bildet av det samme vevet sekvensielt over en periode på dager til uke 7,9.
Utviklingen av nye bildevinduer har blitt fremhevet som et teknologisk behov for å forbedre intravital bildebehandling ytterligere tilnærminger10. Det prototypiske intravitale bildevinduet er en metallring som inneholder en glassdeksler festet til huden med suturer11. Interferens med fri bevegelse, opphopning av ekssudat og skade på glassdekslene er vanlige problemer sett ved bruk av slike vinduer. Videre krever det prototypiske vinduet spesialisert produksjon, og den kirurgiske prosedyren kan kreve omfattende opplæring. For å løse disse problemene ble polydimetylsiloksan (PDMS), en silikonpolymer, som tidligere har blitt brukt i kranialvinduer for langvarig avbildning i hjernen12, tilpasset for bruk i mageorgan og brystkjertelavbildning. Her presenteres en detaljert metode for å generere PDMS-baserte silikonvinduer, inkludert hvordan du kaster vinduet rundt et rutenett i rustfritt stål for å gi landemerker for gjentatt bildebehandling av de samme vevsområdene. Videre er en enkel, stingfri kirurgisk prosedyre for å sette inn vinduet over bukorganer eller brystkjertelen beskrevet. Denne nye tilnærmingen overvinner noen av de vanligste problemene med bildevinduer som brukes for øyeblikket, og øker tilgjengeligheten til langsgående intravital avbildning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intravitale bildevinduer er viktige verktøy for direkte visualisering av fysiologiske og patologiske prosesser ved cellulær oppløsning når de utfolder seg over tid. Den nye prosedyren som er beskrevet for støping og innsetting av fleksible silikonavbildningsvinduer hos mus, overvinner noen av de vanligste problemene med brukte bildevinduer (ekssudat, brudd og interferens med normal mobilitet), gir ekstra sikkerhet for musen og øker tilgjengeligheten til denne teknikken.
De mest brukte bi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Rob Eifert for hans hjelp til å designe og optimalisere de laserskårne rutenettene i rustfritt stål. Dette arbeidet ble støttet av CSHL Cancer Center (P30-CA045508) og midler til M.E. fra National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 og 5P01CA013106-49); CSHL og Northwell Helse; Thompson Family Foundation; Svøm over Hele Amerika; og et stipend fra Simons Foundation til CSHL. M.S. ble støttet av National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Programme Training Award (T32-GM008444) og National Cancer Institute of the NIH under tildeling nummer 1F30CA253993-01. L.M. støttes av et James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship. J.M.A. er mottaker av et Cancer Research Institute/Irvington Postdoctoral Fellowship (CRI Award #3435). D.A.T. støttes av Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research og Thompson Family Foundation. Tegneserier ble laget med Biorender.com.
Materials
| 3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape | 3M | 70200770819 | |
| Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software and sensors | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Antibody | Abcam | ab125212 | |
| Curity gauze sponges | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Two-part, 10:1 mixing ratio |
| Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro 3D printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Far Infrared Heated blanket | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji imaging processing package | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Gating system: | BIOPAC Systems Inc. | The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Module, C Series | DA100C | ||
| Dual Gating Sys small animal | DTU200 | ||
| MP160 for Windows – Analysis system | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V;015000 | ||
| Pressure Pad | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Absorbable gelatin sponge |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody | R&D Systems | AF3667 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP mice | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Servohydraulic material testing machine | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST probe | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. | ||
| Polylactic acid filament | Hatchbox | 1.75 mm diameter | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 wound clips | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Stainless steel grid | Fotofab | One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square. | |
| Surface Treated SterileTissue Culture Plates | Fisher Scientific | FB012929 | Lid used as curing surface for imaging windows |
| TriM Scope Multiphoton Microscope | LaVision BioTec | Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr |
|
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48404-453 |
References
- Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
- Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
- Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
- Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
- Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917 (2014).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Anderson, T. L. . Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).
- Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
