Längsgående intravital avbildning genom tydliga silikonfönster
Summary
Ett tillvägagångssätt presenteras här för långsiktig intravital avbildning med optiskt klara silikonfönster som kan limmas direkt på vävnaden / organet av intresse och huden. Dessa fönster är billigare och mer mångsidiga än andra som för närvarande används i fältet, och den kirurgiska insättningen orsakar begränsad inflammation och nöd för djuren.
Abstract
Intravital mikroskopi (IVM) möjliggör visualisering av cellrörelse, delning och död vid encellsupplösning. IVM genom kirurgiskt införda bildfönster är särskilt kraftfull eftersom det möjliggör longitudinell observation av samma vävnad över dagar till veckor. Typiska bildfönster består av en glasöverdragsglas i en biokompatibel metallram suturerad till musens hud. Dessa fönster kan störa mössens fria rörlighet, framkalla ett starkt inflammatoriskt svar och misslyckas på grund av trasigt glas eller sönderrivna suturer, varav någon kan kräva eutanasi. För att ta itu med dessa problem utvecklades fönster för långvarig bukorgan- och bröstkörtelavbildning från en tunn film av polydimetylsiloxan (PDMS), en optiskt klar silikonpolymer som tidigare användes för kranialavbildningsfönster. Dessa fönster kan limmas direkt på vävnaderna, vilket minskar den tid som behövs för insättning. PDMS är flexibelt, vilket bidrar till dess hållbarhet hos möss över tid – upp till 35 dagar har testats. Longitudinell avbildning är avbildning av samma vävnadsregion under separata sessioner. Ett rostfritt stålnät var inbäddat i fönstren för att lokalisera samma region, vilket möjliggjorde visualisering av dynamiska processer (som bröstkörtelinvolution) på samma platser, med några dagars mellanrum. Detta silikonfönster möjliggjorde också övervakning av enskilda spridda cancerceller som utvecklades till mikrometastaser över tiden. Silikonfönstren som används i denna studie är enklare att sätta in än metallinramade glasfönster och orsakar begränsad inflammation i de avbildade vävnaderna. Dessutom möjliggör inbäddade rutnät enkel spårning av samma vävnadsregion i upprepade avbildningssessioner.
Introduction
Intravital mikroskopi (IVM), avbildning av vävnader i bedövade djur, ger insikter i dynamiken i fysiologiska och patologiska händelser vid cellulär upplösning i intakta vävnader. Tillämpningarna av denna teknik varierar mycket, men IVM har varit avgörande inom cancerbiologiområdet för att hjälpa till att belysa hur cancerceller invaderar vävnader och metastaserar, interagerar med den omgivande mikromiljön och svarar på läkemedel 1,2,3. Dessutom har IVM varit nyckeln till att främja förståelsen av de komplexa mekanismerna som styr immunsvar genom att ge insikter som kompletterar ex vivo-profileringsmetoder (t.ex. flödescytometri). Till exempel har intravitala avbildningsexperiment avslöjat detaljer om immunfunktioner som de relaterar till cellmigration och cell-cellkontakt och har erbjudit en plattform för att kvantitera spatiotemporal dynamik som svar på skada eller infektion 4,5,6,7. Många av dessa processer kan också studeras genom histologisk färgning, men endast IVM tillåter spårning av dynamiska förändringar. Faktum är att medan en histologisk sektion erbjuder en ögonblicksbild av vävnaden vid en given tidpunkt, kan intravital avbildning spåra intercellulära och subcellulära händelser inom samma vävnad över tiden. I synnerhet har framsteg inom fluorescensmärkning och utveckling av molekylära reportrar gjort det möjligt för molekylära händelser att korreleras med cellulära beteenden, såsom proliferation, död, rörlighet och interaktion med andra celler eller den extracellulära matrisen. De flesta IVM-tekniker är baserade på fluorescensmikroskopi, vilket på grund av ljusspridning gör avbildning av djupare vävnader utmanande. Vävnaden av intresse behöver därför ofta exponeras kirurgiskt med ett ofta invasivt och terminalt förfarande. Således, beroende på organplatsen, kan vävnaden avbildas kontinuerligt under en period som varierar från några till 40 h8. Alternativt tillåter den kirurgiska införandet av ett permanent bildfönster avbildning av samma vävnad sekventiellt under en period av dagar till veckor 7,9.
Utvecklingen av nya bildfönster har lyfts fram som ett tekniskt behov av att ytterligare förbättra intravitala bildmetoder10. Det prototypiska intravitala bildfönstret är en metallring som innehåller en glasöverdragslip fäst vid huden med suturer11. Störning av fri rörlighet, ackumulering av exsudat och skador på glasöverdraget är vanliga problem som ses med att använda sådana fönster. Dessutom kräver det prototypiska fönstret specialiserad produktion, och det kirurgiska ingreppet kan kräva omfattande utbildning. För att ta itu med dessa problem anpassades polydimetylsiloxan (PDMS), en silikonpolymer, som tidigare har använts i kranialfönster för långvarig avbildning i hjärnan12, för användning i bukorgan- och bröstkörtelavbildning. Här presenteras en detaljerad metod för att generera PDMS-baserade silikonfönster, inklusive hur man gjuter fönstret runt ett rostfritt stålnät för att ge landmärken för upprepad avbildning av samma vävnadsregioner. Vidare beskrivs ett enkelt, stygnfritt kirurgiskt ingrepp för att sätta in fönstret över bukorganen eller bröstkörteln. Detta nya tillvägagångssätt övervinner några av de vanligaste problemen med för närvarande använda bildfönster och ökar tillgängligheten för longitudinell intravital avbildning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intravitala bildfönster är viktiga verktyg för att direkt visualisera fysiologiska och patologiska processer vid cellulär upplösning när de utvecklas över tiden. Den nya proceduren som beskrivs för gjutning och insättning av flexibla silikonbildfönster hos möss övervinner några av de vanligaste problemen med för närvarande använda bildfönster (exsudat, brytning och störning av normal rörlighet), ger ytterligare säkerhet för musen och ökar tillgängligheten för denna teknik.
<p class="jove_conte…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Rob Eifert för hans hjälp med att designa och optimera de laserskurna rostfria gallren. Detta arbete stöddes av CSHL Cancer Center (P30-CA045508) och medel för ME från National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 och 5P01CA013106-49); CSHL och Northwell Health; Thompson Family Foundation; Simma över Amerika; och ett bidrag från Simons Foundation till CSHL. MS stöddes av National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) och National Cancer Institute of the NIH under tilldelningsnummer 1F30CA253993-01. L.M. stöds av ett James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship. J.M.A. är mottagare av ett Cancer Research Institute / Irvington Postdoctoral Fellowship (CRI Award #3435). D.A.T. stöds av Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research och Thompson Family Foundation. Tecknade serier skapades med Biorender.com.
Materials
| 3M Medipore Soft Cloth Surgical Tape | 3M | 70200770819 | |
| Silk suture 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 22974 | |
| AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Anesthesia system | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software and sensors | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Antibody | Abcam | ab125212 | |
| Curity gauze sponges | Covidien | ||
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | Two-part, 10:1 mixing ratio |
| Round Cover Glass, 8mm Diameter, #1.5 Thickness | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro 3D printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Far Infrared Heated blanket | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji imaging processing package | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carboxylate, 0.04µm, yellow-green (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Gating system: | BIOPAC Systems Inc. | The components together allow monitoring mouse vitals during imaging and gating image acquisition on mouse respiration. All were acquired from BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Module, C Series | DA100C | ||
| Dual Gating Sys small animal | DTU200 | ||
| MP160 for Windows – Analysis system | MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V;015000 | ||
| Pressure Pad | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Absorbable gelatin sponge |
| Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | Two pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
| Human/Mouse Myeloperoxidase/MPO Antibody | R&D Systems | AF3667 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Insulin Syringes with BD Ultra-Fine needle 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurane (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP mice | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4" length |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4" length |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Servohydraulic material testing machine | |
| Neutrophil Elastase 680 FAST probe | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Oxygen | General Welding Supply Corp. | ||
| Polylactic acid filament | Hatchbox | 1.75 mm diameter | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube ophthalmic ointment | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 wound clips | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Stainless steel grid | Fotofab | One grid is 0.200 inches in diameter, with a total of 52 individual grid squares that are 0.016 x 0.016 inches. There is 0.003 inches of space between each square. | |
| Surface Treated SterileTissue Culture Plates | Fisher Scientific | FB012929 | Lid used as curing surface for imaging windows |
| TriM Scope Multiphoton Microscope | LaVision BioTec | Imaging was done on an upright 2-photon microscope (Trimscope, LaVision BioTec) equipped with two Ti:Sapphire lasers (Mai Tai and InSight, Spectra-Physics) and an optical parametric oscillator. The following Longpass Dichroic Beamsplitters (Chroma) were used to direct the signal towards four photomultipler tubes: T560LP T665LPXXR T495lxpr |
|
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro cover glass | VWR | 48404-453 |
References
- Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
- Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184 (2020).
- Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
- Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
- Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
- Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562 (2011).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917 (2014).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818 (2016).
- Anderson, T. L. . Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , (2005).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088 (2013).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562 (2016).
- Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
