Misurazioni del trasferimento di energia di risonanza di Förster in cellule vegetali viventi
Summary
Viene fornito un protocollo per la creazione di un microscopio a scansione laser confocale standard per misure in vivo di trasferimento di energia di risonanza Förster, seguito da una valutazione dei dati.
Abstract
Gli esperimenti FRET (Sensitized emission-based Förster resonance energy transfer) sono facilmente eseguibili ma dipendono dalla configurazione microscopica. I microscopi a scansione laser confocale sono diventati un cavallo di battaglia per i biologi. I sistemi commerciali offrono un’elevata flessibilità nella regolazione della potenza laser e nella sensibilità del rilevatore e spesso combinano diversi rilevatori per ottenere l’immagine perfetta. Tuttavia, il confronto dei dati basati sull’intensità di diversi esperimenti e configurazioni è spesso impossibile a causa di questa flessibilità. Le procedure di compatibilità con i biologi sono vantaggiose e consentono una regolazione semplice e affidabile delle impostazioni del laser e del rilevatore.
Inoltre, poiché gli esperimenti FRET nelle cellule viventi sono influenzati dalla variabilità nell’espressione proteica e nei rapporti donatore-accettore, i livelli di espressione proteica devono essere considerati per la valutazione dei dati. Qui è descritto un semplice protocollo per misurazioni FRET affidabili e riproducibili, comprese le routine per la stima dell’espressione proteica e la regolazione dell’intensità del laser e delle impostazioni del rilevatore. La valutazione dei dati sarà eseguita mediante calibrazione con una fusione fluoroforica di efficienza FRET nota. Per migliorare la semplicità, sono stati confrontati i fattori di correzione che sono stati ottenuti nelle cellule e misurando le proteine fluorescenti ricombinanti.
Introduction
Il trasferimento di energia di risonanza di Förster ((F)RET) è tipicamente osservato dalla spettroscopia di fluorescenza, sebbene il processo stesso non sia limitato a verificarsi tra i fluorofori. L’accoppiamento dipolo-dipolo sottostante richiede semplicemente una molecola donatrice che emette luce e un accettore che assorbe la luce. Questo è derivato dall’integrale J di sovrapposizione spettrale richiesto degli spettri normalizzati di emissione del donatore e di assorbanza dell’accettore1. Tuttavia, poiché ret compete con la fluorescenza, il trasferimento di energia diventa misurabile dalle alterazioni dell’emissione di fluorescenza: RET induce la tempra del donatore e l’emissione di accettori sensibilizzati.
Il RET a base di fluorofori è stato definito trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) per separarlo dal trasferimento di energia di risonanza di bioluminescenza (BRET). La RET dipende fortemente dalla distanza tra donatore e accettore, che è ampiamente nell’intervallo di 0,5-10 nm2 e, quindi, nello stesso intervallo delle dimensioni delle proteine e dei loro complessi. In secondo luogo, RET dipende dall’orientamento dipolo-dipolo kappa al quadrato. In combinazione con il fatto che la libertà rotazionale dei fluorofori legati alle proteine può essere trascurata a causa del peso molecolare e del lento rilassamento rotazionale, RET consente l’analisi delle alterazioni conformazionali3.
Il cosiddetto raggio di Förster si basa sull’integrale di sovrapposizione spettrale e sull’intervallo di lunghezze d’onda della sovrapposizione, in modo che i cromofori che assorbono la luce rossa producano raggi di Förster più lunghi rispetto ai coloranti che assorbono la luce blu. Poiché la gamma dinamica delle misurazioni FRET è limitata da 0,5 × R0 e 1,5 × R0, la coppia FRET ECFP-EYFP ha una gamma dinamica di 2,5-7,3 nm grazie al suo R0 di 4,9 nm4.
La luminosità di un fluoroforo è data dal prodotto del suo coefficiente di estinzione molare e dalla sua resa quantistica. Per le misurazioni FRET, è vantaggioso scegliere fluorofori di luminosità quasi simile. Ciò migliora il rilevamento della tempra del donatore e l’emissione di accettori sensibilizzati. Favorisce inoltre la calibrazione del sistema di microscopia. Osservando le coppie FRET frequentemente utilizzate di proteine ciano e fluorescenti, la minore luminosità delle proteine fluorescenti ciano diventa evidente (Figura 1A).
Tuttavia, la durata dell’accettore deve essere inferiore alla durata di vita del donatore, garantendo la disponibilità dell’accettore per il trasferimento di energia. Se la vita dell’accettore supera la vita del donatore, l’accettore potrebbe essere ancora nello stato eccitato quando il donatore è di nuovo eccitato. Le proteine fluorescenti ciano avanzate come mTurquoise mostrano una durata prolungata e quindi contribuiscono ad aumentare la probabilità di FRET (Figura 1B). La probabilità di FRET dipende anche dal coefficiente di estinzione molare dell’accettore.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’estinzione del donatore e l’emissione di accettori sensibilizzati sono caratterizzate da una relazione lineare che consente il calcolo basato sul donatore o sull’accettore di FRET. I corrispondenti fattori di linearità sono chiamati fattore G (da donatore ad accettore) o xi (da accettore a donatore), che sono valori reciproci4. La misurazione del FRET tra proteine fluorescenti mediante microscopia a fluorescenza richiede spesso correzioni per DSBT e ASBT a causa dell’ampio spettro di assorbimen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli esperimenti sono stati eseguiti presso la Light Microscopy Technology Platform (LiMiTec) della Facoltà di Biologia dell’Università di Bielefeld. Questo lavoro è stato finanziato dall’Università di Bielefeld.
Materials
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
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