Modification chimique du résidu de tryptophane dans un domaine N recombinant Ca2+-ATPasepour l’étude du tryptophane-ANS FRET

Résumé

ANS se lie au domaine N recombinant Ca²⁺-ATPase. Les spectres de fluorescence affichent un motif de type FRET lors de l’excitation à une longueur d’onde de 295 nm. La modification chimique du Trp médiée par le NBS éteint la fluorescence du domaine N, ce qui conduit à l’absence de transfert d’énergie (FRET) entre le résidu Trp et le SNA.

Résumé

Le sarco/réticulum endoplasmique Ca²⁺-ATPase (SERCA) est une ATPase de type P qui a été cristallisée en diverses conformations. Des informations fonctionnelles détaillées peuvent néanmoins être obtenues à partir de domaines recombinants isolés. Le domaine de liaison aux nucléotides recombinants (domaine N) (Trp552Leu et Tyr587Trp) d’ingénierie (Trp552Leu et Tyr587Trp) affiche une trempe par fluorescence lors de la liaison au ligand. Un fluorophore extrinsèque, à savoir le sulfonate de 8-anilino-1-naphtalène (SNA), se lie au site de liaison aux nucléotides par des interactions électrostatiques et hydrophobes avec les résidus d’Arg, His, Ala, Leu et Phe. La liaison ANS est mise en évidence par l’augmentation de l’intensité de fluorescence lorsqu’elle est excitée à une longueur d’onde (λ) de 370 nm. Cependant, lorsqu’il est excité à λ de 295 nm, l’augmentation de l’intensité de fluorescence semble être couplée à la trempe de la fluorescence intrinsèque du domaine N. Les spectres de fluorescence présentent un modèle de transfert d’énergie de résonance de Föster (FRET), suggérant ainsi la présence d’une paire Trp-ANS FRET, qui semble être soutenue par la courte distance (~20 Å) entre Tyr587Trp et ANS. Cette étude décrit une analyse de la paire Trp-ANS FRET par modification chimique Trp (et trempe par fluorescence) qui est médiée par le N-bromosuccinimide (NBS). Dans le domaine N chimiquement modifié, la fluorescence ANS augmentait lorsqu’elle était excitée à un λ de 295 nm, de la même manière que lorsqu’elle était excitée à un λ de 370 nm. Par conséquent, la modification chimique médiée par le NBS du résidu de Trp peut être utilisée pour sonder l’absence de FRET entre Trp et ANS. En l’absence de fluorescence Trp, il ne faut pas observer une augmentation de la fluorescence ANS. La modification chimique des résidus de Trp dans les protéines par le NBS peut être utile pour examiner le FRET entre les résidus de Trp qui sont proches du SNA lié. Ce test sera probablement également utile lors de l’utilisation d’autres fluorophores.

Introduction

Le transfert d’énergie par résonance de Föster (FRET) est devenu une technique standard pour déterminer la distance entre les structures moléculaires après liaison ou interaction dans les études de structure et de fonction des protéines^1,2,3,4. Dans les ATPases de type P, FRET a été utilisé pour étudier la structure et la fonction du réticulum sarco-endoplasmique Ca²⁺-ATPase (SERCA)^2,5,6,7,

Protocole

1. Détermination (in silico) de l’interaction ans et SERCA du domaine N

1. Générer une structure tridimensionnelle (3D) de la protéine (domaine N SERCA) par modélisation moléculaire à l’aide du logiciel de modélisation protéique préféré⁵⁰.
2. Identifier les résidus d’acides aminés qui forment le site de liaison aux nucléotides à l’aide du logiciel de structure moléculaire préféré⁵¹, et déterminer la présence de résidus Arg et Lys³⁵; ceux-ci sont nécessaires pour la liaison ANS et pour augmenter l’intensité de fluorescence (rendement quantique).
3. Effectuer un amarrag....

Résultats

L’amarrage moléculaire montre la liaison de l’ANS au site de liaison aux nucléotides du domaine N via des interactions électrostatiques et hydrophobes(Figure 1). La distance moléculaire (20 Å) entre le résidu Trp et le SNA (lié au site de liaison aux nucléotides) soutient l’apparition de FRET (Figure 1). Le domaine N recombinant conçu (conçu) a été obtenu à haute pureté par chromatographie d’affinité(Figure 2)et convenait aux expéri.......

Discussion

Les spectres de fluorescence du complexe ans-N-domaine présentent un motif de type FRET lorsqu’ils sont excités à un λ de 295 nm, tandis que la distance moléculaire (20 Å) entre le résidu Trp et ANS semble soutenir l’apparition de FRET (Figure 1). La modification chimique du Trp par le NBS donne un domaine N moins fluorescent(Figure 3B, Spectre f); par conséquent, le transfert d’énergie n’est pas possible. Les spectres de fluorescence ANS sont similaires à ceux .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acrylamide	Bio-Rad	1610107	SDS-PAGE
Persulfate d’ammonium	Bio-Rad	1610700	SDS-PAGE
8-Anilino-1-naphtalènesulfonique	Acide Sigma-Aldrich	A1028	Fluorophore
Bis-acrylamide	Bio-Rad	1610125	SDS-PAGE
N-Bromosuccinimide	Sigma-Aldrich	B81255	Chimique modification
N,N-diméthylformamide	J.T. Baker	9213-12	Préparation de la solution mère
Isothiocyanate de fluorescéine	Sigma-Aldrich	F7250	Marqueur de fluorescence
chimique Cuvette de fluorescence	Hellma	Z801291	Dosage de fluorescence
Spectrofluorescence	Shimadzu	RF 5301PC	Dosage
HisTrap&trade ; FF	GE Healtcare	11-0004-59	Purification des protéines
IPTG, sans dioxane	American Bionalytical	AB00841-00010	Expression des protéines
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513-25G	Purification des protéines
LB media	Fisher Scientific	10000713	Culture cellulaire
Pipetman L P10L	Gilson	FA10002M	Fluorescence dosage
Pipetman L P100L	Gilson	FA10004M	Dosage de fluorescence
Pipetman L P200L	Gilson	FA10005M	Dosage de fluorescence
Pipetman L P1000L Gilson		FA10006M	Dosage de fluorescence
Pipetman L P5000L	Gilson	FA10007	Dosage de fluorescence
Precision plus std	Bio-Rad	1610374	SDS-PAGE
Dodécylsulfate de sodium	Bio-Rad	1610302	SDS-PAGE
Phosphate de sodium dibasique	J.T. Baker	3828-19 Préparation de	tampon
Phosphate de sodium monobasique	J.T. Baker	3818-01	Préparation de tampon
Filtre de seringue 0,2 um	Millipore	GVWP04700	Filtration de solution
Temed	Bio-Rad	1610801	PAGE DE DONNÉES DE SÉCURITÉ
Tris	Bio-Rad	1610719	FDS-PAGE

de fluorescence