Автоматизированное культивирование микробов и адаптивная эволюция с использованием системы микробной микробной культуры (MMC)
Summary
Этот протокол описывает, как использовать систему микробной микробной культуры (MMC) для проведения автоматизированного культивирования микробов и адаптивной эволюции. MMC может культивировать и субкультурировать микроорганизмы автоматически и непрерывно и отслеживать их рост в режиме онлайн с относительно высокой пропускной способностью и хорошим распараллеливанием, снижая потребление труда и реагентов.
Abstract
Обычные методы культивирования микробов обычно имеют громоздкие операции, низкую пропускную способность, низкую эффективность и большое потребление труда и реагентов. Кроме того, высокопроизводительные методы культивирования на основе микропластин, разработанные в последние годы, имеют плохой статус роста микробов и распараллеливание эксперимента из-за их низкого содержания растворенного кислорода, плохой смеси и сильного испарения и теплового эффекта. Благодаря многим преимуществам микрокапелей, таким как небольшой объем, высокая пропускная способность и сильная управляемость, микрофлюидная технология на основе капель может преодолеть эти проблемы, которая использовалась во многих видах исследований высокопроизводительного микробного культивирования, скрининга и эволюции. Однако большинство предшествующих исследований остаются на стадии лабораторного строительства и применения. Некоторые ключевые проблемы, такие как высокие эксплуатационные требования, высокая сложность строительства и отсутствие технологии автоматизированной интеграции, ограничивают широкое применение капельной микрофлюидной технологии в микробных исследованиях. Здесь была успешно разработана автоматизированная система микробной микробной культуры (MMC) на основе капельной микрофлюидной технологии, обеспечивающая интеграцию таких функций, как посев, культивирование, онлайн-мониторинг, субкультурирование, сортировка и отбор проб, необходимые для процесса культивирования микробных капель. В этом протоколе в качестве примеров были взяты Escherichia coli дикого типа (E. coli) MG1655 и метанол-эссенциальный штамм E. coli (MeSV2.2), чтобы представить, как использовать MMC для проведения автоматизированного и относительно высокопроизводительного микробного культивирования и адаптивной эволюции в деталях. Этот метод прост в эксплуатации, потребляет меньше труда и реагентов, а также имеет высокую экспериментальную пропускную способность и хорошую параллельность данных, что имеет большие преимущества по сравнению с обычными методами культивирования. Он обеспечивает недорогую, удобную в эксплуатации и надежную экспериментальную платформу для научных исследователей для проведения соответствующих микробных исследований.
Introduction
Культивирование микроорганизмов является важной основой для микробиологических научных исследований и промышленного применения, которое широко используется в выделении, идентификации, реконструкции, скрининге и эволюции микроорганизмов 1,2,3. Обычные методы культивирования микробов в основном используют пробирки, колбы для встряхивания и твердые пластины в качестве контейнеров для культивирования в сочетании с встряхивающими инкубаторами, спектрофотометрами, считывателями микропластин и другим оборудованием для культивирования, обнаружения и скрининга микробов. Однако эти методы имеют много проблем, таких как громоздкие операции, низкая пропускная способность, низкая эффективность и большое потребление труда и реагентов. Высокопроизводительные методы культивирования, разработанные в последние годы, в основном основаны на микропластине. Но микропластина имеет низкий уровень растворенного кислорода, плохие перемешивающие свойства, а также сильное испарение и тепловое воздействие, которые часто приводят к плохому состоянию роста и экспериментальному распараллеливанию микроорганизмов 4,5,6,7; с другой стороны, он должен быть оснащен дорогостоящим оборудованием, таким как рабочие станции для обработки жидкостей и считыватели микропластин, для достижения автоматизированного выращивания и обнаружения процессов 8,9.
Как важная отрасль микрофлюидной технологии, капельная микрофлюидика была разработана в последние годы на основе традиционных микрофлюидных систем непрерывного потока. Это дискретная проточная микрофлюидная технология, которая использует две несмешивающиеся жидкие фазы (обычно масло-вода) для генерации дисперсных микрокапелей и работы на них10. Поскольку микрокапли имеют характеристики малого объема, большой удельной площади поверхности, высокой внутренней скорости массопереноса и отсутствия перекрестного загрязнения, вызванного компартментализацией, а также преимущества сильной управляемости и высокой пропускной способности капель, было проведено много видов исследований с применением микрофлюидной технологии капель в высокопроизводительном культивировании, скрининге и эволюции микроорганизмов11 . Тем не менее, все еще существует ряд ключевых проблем, чтобы сделать микрофлюидную технологию капель популяризированной и широко применяемой. Во-первых, работа капельной микрофлюидики громоздка и сложна, что приводит к высоким техническим требованиям к операторам. Во-вторых, капельная микрофлюидная технология сочетает в себе оптические, механические и электрические компоненты и должна быть связана со сценариями применения биотехнологии. Одной лаборатории или команде трудно построить эффективные системы микрофлюидного контроля капель, если нет междисциплинарного сотрудничества. В-третьих, из-за небольшого объема микрокапли (от пиколитра (pL) до микролитра (μL)) требуется много трудностей для реализации точного автоматизированного управления и онлайн-обнаружения капель в режиме реального времени для некоторых основных микробных операций, таких как субкультуризация, сортировка и отбор проб, а также трудно построить интегрированную систему оборудования12.
Для решения вышеуказанных проблем была успешно разработана автоматическая система микробной микрокапельной культуры (MMC) на основе капельной микрофлюидной технологии13. MMC состоит из четырех функциональных модулей: модуля распознавания капель, модуля обнаружения спектра капель, модуля микрофлюидного чипа и модуля выборки. Благодаря системной интеграции и управлению всеми модулями точно устанавливается автоматизированная система управления, включая генерацию, культивирование, измерение (оптическая плотность (OD) и флуоресценция), расщепление, слияние, сортировку капель, достигая интеграции таких функций, как посев, культивирование, мониторинг, субкультурирование, сортировка и отбор проб, необходимые для процесса выращивания микробных капель. MMC может вмещать до 200 реплицированных единиц выращивания капель объемом 2-3 мкл, что эквивалентно 200 единицам культивирования колбы. Система культивирования микрокаплет может удовлетворять требованиям к незагрязнению, растворенному кислороду, смешиванию и массо-энергетическому обмену во время роста микроорганизмов и удовлетворять различные потребности микробных исследований с помощью многочисленных интегрированных функций, например, измерения кривой роста, адаптивной эволюции, однофакторного многоуровневого анализа и исследования и анализа метаболитов (на основе обнаружения флуоресценции)13,14.
Здесь протокол подробно описывает, как использовать MMC для проведения автоматизированного и микробного культивирования и адаптивной эволюции (рисунок 1). Мы взяли кишечную палочку дикого типа (E. coli) MG1655 в качестве примера, чтобы продемонстрировать измерение кривой роста и метанол-эссенциальный штамм E. coli MeSV2.215, чтобы продемонстрировать адаптивную эволюцию в MMC. Было разработано операционное программное обеспечение для MMC, которое делает операцию очень простой и понятной. Во всем процессе пользователю необходимо приготовить исходный раствор бактерий, установить условия MMC, а затем ввести раствор бактерий и связанные с ним реагенты в MMC. Впоследствии MMC будет автоматически выполнять такие операции, как генерация капель, распознавание и нумерация, культивирование и адаптивная эволюция. Он также будет выполнять онлайн-обнаружение (OD и флуоресценция) капель с высоким временным разрешением и отображать соответствующие данные (которые могут быть экспортированы) в программном обеспечении. Оператор может остановить процесс культивирования в любое время в соответствии с результатами и извлечь целевые капли для последующих экспериментов. MMC прост в эксплуатации, потребляет меньше труда и реагентов, а также имеет относительно высокую экспериментальную пропускную способность и хорошую параллель данных, что имеет значительные преимущества по сравнению с обычными методами культивирования. Он обеспечивает недорогую, удобную в эксплуатации и надежную экспериментальную платформу для исследователей для проведения соответствующих микробных исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе представлено, как использовать систему микробной микробной культуры (MMC) для выполнения автоматизированного культивирования микробов и долгосрочной адаптивной эволюции. MMC представляет собой миниатюрную, автоматизированную и высокопроизводительную систему культив?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2018YFA0901500), Национальным проектом ключевых научных приборов и оборудования Национального фонда естественных наук Китая (21627812) и Программой научных исследований Инициативы Университета Цинхуа (20161080108). Мы также благодарим профессора Юлию А. Ворхольт (Институт микробиологии, департамент биологии, ETH Zurich, Zurich 8093, Швейцария) за предоставление метанол-эссенциального штамма E. coli версии 2.2 (MeSV2.2).
Materials
| 0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
| 4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
| Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
| EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
| FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
| Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
| High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
| Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
| Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
| Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
| Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
| Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
| Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
| Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
| Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
| UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
| Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
References
- Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
- Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
- Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).
- Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
- Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
- Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
- Huber, R., et al. Robo-Lector – a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
- Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
- Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
- Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
- Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
- Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).
- Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508 (2018).
- Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
- Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
- Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
- Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
- Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
- Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998 (2020).
- Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
- Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
- Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).
