Coltivazione microbica automatizzata ed evoluzione adattiva utilizzando il sistema di coltura microbica di microgoccioline (MMC)
Summary
Questo protocollo descrive come utilizzare il sistema di coltura microbica di microgoccioline (MMC) per condurre la coltivazione microbica automatizzata e l’evoluzione adattativa. MMC può coltivare e sub-coltivare microrganismi automaticamente e continuamente e monitorare online la loro crescita con una produttività relativamente elevata e una buona parallelizzazione, riducendo il consumo di manodopera e reagenti.
Abstract
I metodi di coltivazione microbica convenzionali di solito hanno operazioni ingombranti, bassa produttività, bassa efficienza e grande consumo di manodopera e reagenti. Inoltre, i metodi di coltivazione ad alto rendimento basati su micropiastre sviluppati negli ultimi anni hanno uno scarso stato di crescita microbica e sperimentano la parallelizzazione a causa del loro basso livello di ossigeno disciolto, della scarsa miscela e della grave evaporazione e dell’effetto termico. A causa dei numerosi vantaggi delle micro-goccioline, come il piccolo volume, l’elevata produttività e la forte controllabilità, la tecnologia microfluidica a base di goccioline può superare questi problemi, che è stata utilizzata in molti tipi di ricerca di coltivazione, screening ed evoluzione microbica ad alto rendimento. Tuttavia, la maggior parte degli studi precedenti rimane nella fase di costruzione e applicazione del laboratorio. Alcune questioni chiave, come gli elevati requisiti operativi, l’elevata difficoltà di costruzione e la mancanza di tecnologia di integrazione automatizzata, limitano l’ampia applicazione della tecnologia microfluidica a goccioline nella ricerca microbica. Qui, un sistema automatizzato di coltura microbica a microgoccioline (MMC) è stato sviluppato con successo basato sulla tecnologia microfluidica delle goccioline, ottenendo l’integrazione di funzioni come l’inoculazione, la coltivazione, il monitoraggio online, la sottocoltivazione, lo smistamento e il campionamento richiesti dal processo di coltivazione microbica delle goccioline. In questo protocollo, l’Escherichia coli (E. coli) MG1655 wild-type e un ceppo di E. coli essenziale per il metanolo (MeSV2.2) sono stati presi come esempi per introdurre come utilizzare l’MMC per condurre in dettaglio la coltivazione microbica automatizzata e relativamente ad alto rendimento e l’evoluzione adattativa. Questo metodo è facile da usare, consuma meno manodopera e reagenti e ha un’elevata produttività sperimentale e una buona parallelità dei dati, che presenta grandi vantaggi rispetto ai metodi di coltivazione convenzionali. Fornisce una piattaforma sperimentale a basso costo, favorevole alle operazioni e affidabile in termini di risultati per i ricercatori scientifici per condurre ricerche microbiche correlate.
Introduction
La coltivazione microbica è una base importante per la ricerca scientifica microbiologica e le applicazioni industriali, che è ampiamente utilizzata nell’isolamento, identificazione, ricostruzione, screening ed evoluzione dei microrganismi 1,2,3. I metodi di coltivazione microbica convenzionali utilizzano principalmente provette, fiaschi di scuotimento e piastre solide come contenitori di coltivazione, combinati con incubatori vibranti, spettrofotometri, lettori di micropiastre e altre attrezzature per la coltivazione, il rilevamento e lo screening microbico. Tuttavia, questi metodi hanno molti problemi, come operazioni ingombranti, bassa produttività, bassa efficienza e grande consumo di manodopera e reagenti. I metodi di coltivazione ad alto rendimento sviluppati negli ultimi anni si basano principalmente sulla micropiastra. Ma la micropiastra ha un basso livello di ossigeno disciolto, scarsa proprietà di miscelazione e grave evaporazione ed effetto termico, che spesso portano a uno scarso stato di crescita e alla parallelizzazione sperimentale di microrganismi 4,5,6,7; d’altra parte, deve essere dotato di attrezzature costose, come stazioni di lavoro per la gestione dei liquidi e lettori di micropiastre, per ottenere la coltivazione automatizzata e il rilevamento dei processi 8,9.
Come importante branca della tecnologia microfluidica, la microfluidica a goccioline è stata sviluppata negli ultimi anni sulla base di sistemi microfluidici tradizionali a flusso continuo. Si tratta di una tecnologia microfluidica a flusso discreto che utilizza due fasi liquide immiscibili (solitamente olio-acqua) per generare micro-goccioline disperse e operare su di esse10. Poiché le micro-goccioline hanno le caratteristiche di un piccolo volume, un’ampia superficie specifica, un’elevata velocità di trasferimento di massa interna e nessuna contaminazione incrociata causata dalla compartimentazione, e i vantaggi di una forte controllabilità e di un’elevata produttività delle goccioline, ci sono stati molti tipi di ricerca che applicano la tecnologia microfluidica delle goccioline nella coltivazione, nello screening e nell’evoluzione dei microrganismi ad alto rendimento11 . Tuttavia, ci sono ancora una serie di questioni chiave per rendere la tecnologia microfluidica a goccioline popolare e ampiamente applicata. In primo luogo, il funzionamento della microfluidica delle goccioline è ingombrante e complesso, con conseguenti elevati requisiti tecnici per gli operatori. In secondo luogo, la tecnologia microfluidica a goccioline combina componenti ottici, meccanici ed elettrici e deve essere associata a scenari applicativi biotecnologici. È difficile per un singolo laboratorio o team costruire sistemi di controllo microfluidici a goccia efficienti se non esiste una collaborazione multidisciplinare. In terzo luogo, a causa del piccolo volume di micro-goccioline (dal picoliter (pL) al microlitro (μL)), ci vuole molta difficoltà per realizzare il controllo automatizzato preciso e il rilevamento online in tempo reale delle goccioline per alcune operazioni microbiche di base come la sottocoltura, la cernita e il campionamento, ed è anche difficile costruire un sistema di apparecchiature integrato12.
Al fine di affrontare i problemi di cui sopra, è stato sviluppato con successo un sistema automatico di coltura microbica di microgoccioline (MMC) basato sulla tecnologia microfluidica delle goccioline13. L’MMC è costituito da quattro moduli funzionali: un modulo di riconoscimento delle goccioline, un modulo di rilevamento dello spettro delle goccioline, un modulo chip microfluidico e un modulo di campionamento. Attraverso l’integrazione e il controllo del sistema di tutti i moduli, viene stabilito con precisione il sistema operativo automatizzato che include la generazione, la coltivazione, la misurazione (densità ottica (OD) e fluorescenza), la scissione, la fusione, lo smistamento delle goccioline, ottenendo l’integrazione di funzioni come l’inoculazione, la coltivazione, il monitoraggio, la sottocoltura, lo smistamento e il campionamento richiesti dal processo di coltivazione microbica delle goccioline. MMC può contenere fino a 200 unità di coltivazione di goccioline replicate di 2-3 μL di volume, che equivale a 200 unità di coltivazione del pallone shake. Il sistema di coltivazione a micro-goccioline può soddisfare i requisiti di non contaminazione, ossigeno disciolto, miscelazione e scambio massa-energia durante la crescita di microrganismi e soddisfare le varie esigenze della ricerca microbica attraverso molteplici funzioni integrate, ad esempio la misurazione della curva di crescita, l’evoluzione adattativa, l’analisi multilivello a fattore singolo e la ricerca e l’analisi dei metaboliti (basata sul rilevamento della fluorescenza)13,14.
Qui, il protocollo introduce in dettaglio come utilizzare l’MMC per condurre la coltivazione automatizzata e microbica e l’evoluzione adattiva (Figura 1). Abbiamo preso eseguito come esempio Escherichia coli (E. coli) MG1655 per dimostrare la misurazione della curva di crescita e un ceppo di E. coli meSV2.215 essenziale per il metanolo per dimostrare l’evoluzione adattativa in MMC. È stato sviluppato un software operativo per MMC, che rende l’operazione molto semplice e chiara. Nell’intero processo, l’utente deve preparare la soluzione batterica iniziale, impostare le condizioni dell’MMC e quindi iniettare la soluzione batterica e i relativi reagenti nell’MMC. Successivamente, l’MMC eseguirà automaticamente operazioni come la generazione di goccioline, il riconoscimento e la numerazione, la coltivazione e l’evoluzione adattiva. Eseguirà inoltre il rilevamento online (OD e fluorescenza) delle goccioline con alta risoluzione temporale e visualizzerà i relativi dati (che possono essere esportati) nel software. L’operatore può interrompere il processo di coltivazione in qualsiasi momento in base ai risultati ed estrarre le goccioline target per gli esperimenti successivi. L’MMC è facile da usare, consuma meno manodopera e reagenti e ha un throughput sperimentale relativamente elevato e una buona parallelità dei dati, che presenta vantaggi significativi rispetto ai metodi di coltivazione convenzionali. Fornisce una piattaforma sperimentale a basso costo, favorevole alle operazioni e robusta per i ricercatori per condurre ricerche microbiche correlate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo presenta come utilizzare il sistema di coltura microbica di microgoccioline (MMC) per eseguire la coltivazione microbica automatizzata e l’evoluzione adattiva a lungo termine. MMC è un sistema di coltivazione microbica miniaturizzato, automatizzato e ad alto rendimento. Rispetto ai metodi e agli strumenti di coltivazione microbici convenzionali ad alta produttività, MMC presenta molti vantaggi come il basso consumo di manodopera e reagenti, il funzionamento semplice, il rilevamento online (OD e fluore…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dal National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901500), dal National Key Scientific Instrument and Equipment Project della National Natural Science Foundation of China (21627812) e dal Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). Ringraziamo anche la Prof.ssa Julia A. Vorholt (Istituto di Microbiologia, Dipartimento di Biologia, ETH Zurigo, Zurigo 8093, Svizzera) per la fornitura del ceppo di E. coli essenziale per metanolo versione 2.2 (MeSV2.2).
Materials
| 0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
| 4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
| Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
| EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
| FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
| Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
| High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
| Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
| Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
| Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
| Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
| Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
| Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
| Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
| Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
| UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
| Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
References
- Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
- Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
- Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).
- Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
- Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
- Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
- Huber, R., et al. Robo-Lector – a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
- Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
- Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
- Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
- Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
- Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).
- Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508 (2018).
- Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
- Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
- Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
- Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
- Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
- Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998 (2020).
- Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
- Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
- Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).
