Formulazione e modulazione acustica di nanogoccioline di perfluorocarburi vaporizzate otticamente

Summary

Le nanogoccioline di perfluorocarburo attivate otticamente mostrano risultati promettenti nelle applicazioni di imaging al di fuori del sistema vascolare. Questo articolo dimostrerà come sintetizzare queste particelle, reticolare i fantasmi di poliacrilammide e modulare acusticamente le goccioline per migliorare il loro segnale.

Abstract

Le microbolle sono l’agente di contrasto di imaging più comunemente usato negli ultrasuoni. Tuttavia, a causa delle loro dimensioni, sono limitati ai compartimenti vascolari. Queste microbolle possono essere condensate o formulate come nanogoccioline di perfluorocarburi (PFCnD) che sono abbastanza piccole da stravasare e quindi essere attivate acusticamente nel sito bersaglio. Queste nanoparticelle possono essere ulteriormente migliorate includendo un assorbitore ottico come colorante organico nel vicino infrarosso o nanoparticelle (ad esempio, nanoparticelle di solfuro di rame o nanoparticelle d’oro / nanobarre). I PFCnD etichettati otticamente possono essere vaporizzati attraverso l’irradiazione laser in un processo noto come vaporizzazione ottica delle gocce (ODV). Questo processo di attivazione consente l’uso di nuclei di perfluorocarburi ad alto punto di ebollizione, che non possono essere vaporizzati acusticamente al di sotto della soglia massima dell’indice meccanico per la diagnostica per immagini. I nuclei con un punto di ebollizione più alto producono goccioline che si ricondensano dopo la vaporizzazione, con conseguente PFCnD “lampeggiante” che producono brevemente contrasto dopo la vaporizzazione prima di condensarsi di nuovo in forma di nanogocce. Questo processo può essere ripetuto per produrre contrasto su richiesta, consentendo l’imaging senza sfondo, il multiplexing, la super-risoluzione e il miglioramento del contrasto attraverso la modulazione ottica e acustica. Questo articolo dimostrerà come sintetizzare PFCnD a guscio lipidico attivabili otticamente utilizzando la sonicazione della sonda, creare fantocci in poliacrilammide per caratterizzare le nanogoccioline e modulare acusticamente i PFCnD dopo ODV per migliorare il contrasto.

Introduction

Le microbolle sono l’agente di contrasto ad ultrasuoni più diffuso grazie alla loro biocompatibilità e all’eccellente ecogenicità rispetto ai tessuti molli. Questo li rende strumenti preziosi per visualizzare il flusso sanguigno, la delineazione degli organi e altre applicazioni¹. Tuttavia, le loro dimensioni (1-10 μm), che li rendono eccezionali per l’imaging in base alla loro frequenza di risonanza, limitano le loro applicazioni al sistema vascolare².

Questa limitazione ha portato allo sviluppo di PFCnD, che sono nano-emulsioni composte da un tensioattivo racchiuso attorno a un nucleo di perfluorocarburi liquido. Queste nanoparticelle possono essere sintetizzate a dimensioni fino a 200 nm e sono progettate per sfruttare la vascolarizzazione o i pori “permeabili” e le fenestrature aperte presenti nel sistema montante tumorale. Mentre queste interruzioni sono dipendenti dal tumore, questa permeabilità consente lo stravaso di nanoparticelle da ~ 200 nm – 1,2 μm a seconda del tumore ^3,4. Nella loro forma iniziale, queste particelle producono poco o nessun contrasto ad ultrasuoni. Dopo la vaporizzazione – indotta acusticamente o otticamente – la fase centrale cambia da liquido a gas, inducendo un aumento da due e mezzo a cinque volte del diametro ^5,6,7 e generando contrasto fotoacustico e ultrasonico. Mentre la vaporizzazione acustica è il metodo di attivazione più comune, questo approccio crea artefatti acustici che limitano l’imaging della vaporizzazione. Inoltre, la maggior parte dei perfluorocarburi richiede ultrasuoni focalizzati con un indice meccanico oltre la soglia di sicurezza per vaporizzare⁸. Ciò ha portato allo sviluppo di PFCnD con punto di ebollizione inferiore, che possono essere sintetizzati condensando microbolle in nanogoccioline⁹. Tuttavia, queste goccioline sono più volatili e soggette a vaporizzazione spontanea¹⁰.

La vaporizzazione ottica delle gocce (ODV), d’altra parte, richiede l’aggiunta di un trigger ottico come le nanoparticelle 11,12,13 o il colorante 6,14,15 e può vaporizzare perfluorocarburi con punto di ebollizione più alto utilizzando fluenze entro il limite di sicurezza ANSI 11. I PFCnD sintetizzati con nuclei con punto di ebollizione più alto sono più stabili e si ricondensano dopo la vaporizzazione, consentendo l’imaging senza sfondo¹⁶, il multiplexing 17 e la super-risoluzione¹⁸. Uno dei principali limiti di queste tecniche è il fatto che i PFCnD ad alto punto di ebollizione sono ecogenici dopo la vaporizzazione solo per un breve periodo di tempo, sulla scala dei millisecondi¹⁹, e sono relativamente deboli. Mentre questo problema può essere mitigato attraverso vaporizzazioni ripetute e la media, il rilevamento e la separazione del segnale delle goccioline rimane una sfida.

Prendendo ispirazione dall’inversione del polso, la durata e il contrasto possono essere migliorati modificando la fase dell’impulso di imaging ad ultrasuoni¹⁹. Avviando l’impulso di imaging ad ultrasuoni con una fase di rarefazione (n-impulso), aumenta sia la durata che il contrasto dei PFCnD vaporizzati. Al contrario, l’avvio dell’impulso di imaging a ultrasuoni con una fase di compressione (p-pulse), si traduce in un contrasto ridotto e in una durata più breve. Questo articolo descriverà come sintetizzare nanogoccioline di perfluorocarburi attivabili otticamente, fantocci di poliacrilammide comunemente usati nell’imaging e dimostrare il miglioramento del contrasto e una migliore longevità del segnale attraverso la modulazione acustica.

Protocol

1. Formulazione di nanogoccioline di perfluorocarburo Risciacquare un matraccio a fondo tondo da 10 mL con cloroformio e lavare una siringa di vetro a tenuta di gas da 10 μL e 1 mL con cloroformio aspirando ripetutamente l’intero volume della siringa ed espellendolo per un totale di tre volte.ATTENZIONE: Il cloroformio è volatile e può essere tossico se inalato. Tutti i lavori con questo solvente devono essere eseguiti in una cappa aspirante. Utilizzando le siringhe, aggiungere 200 μL di DSPE-…

Representative Results

La corretta formulazione e separazione centrifuga dei PFCnD dovrebbe produrre goccioline di circa 200-300 nm di diametro (Figura 1A). Le goccioline separate in modo improprio possono mostrare piccoli picchi intorno a 1 μm. Queste soluzioni possono essere ulteriormente sonicate per rompere le goccioline più grandi. La dimensione delle goccioline aumenterà nel tempo a causa della coalescenza e/o della diffusione in un processo noto come Ostwald maturando21,22</s…

Discussion

La sonicazione della sonda è un metodo relativamente semplice e facile da imparare per fabbricare PFCnD. Ci sono alcuni passaggi in cui è necessario prestare attenzione. Quando si maneggia il cloroformio, è imperativo utilizzare una pipetta a spostamento positivo o siringhe di vetro, poiché è volatile e “perde” dalle pipette a spostamento d’aria standard. Inoltre, se si utilizza uno spostamento positivo, assicurarsi che venga utilizzata una punta appropriata poiché il cloroformio dissolverà la maggior parte delle …

Materials

Ammonium Persulfate (APS)	VWR	97064-592
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365C	Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG)	Avanti Polar Lipids	880120C	Lipids, these can be purchased suspended in chloroform or in powder form. For long term storage, powder form is the best but chloroform is more practical.
Acrylamide : Bisacrylamide solution (19:1) 40% (w/v), OmniPur®	VWR	EM-1300	acrylamide solution, lower concentration/ powder
IR-1048	Sigma	405175	Infrared dye
L11-4v	Verasonics	–	ultrasound linear array transducer
Microtip 1/8"	Qsonica LLC	4418	microtip for probe sonicator
N, N, N′, N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED)	VWR	97064-902	Used to polymerize polyacrylamide by forming free radicals in the presence of ammonium persulfate
Nova II	Ophir-Spiricon	7Z01550	laser power meter
Perfluorohexane	Fluoromed	APF-60M	perfluorocarbon liquid
Phosphate buffered saline (PBS) tablets	VWR	97062-732	Tablets used to make PBS
Q500	Qsonica LLC	Q500-110	Probe sonicator
Silica gel	Sigma-Aldrich	288500	2-25 μm particle size
Tempest 30	New wave research	–	Pulsed laser system
Vantage 128	Verasonics	–	research ultrasound imaging system
Zetasizer Nano ZS	Malvern Instruments Ltd	–	Makes size measurements based on dynamic light scattering