Summary
光遗传学是一种功能强大的工具，具有广泛的应用。该协议演示了如何使用蓝光响应 TAEL/C120 系统在斑马鱼胚胎中实现光诱导基因表达。
Abstract
诱导基因表达系统是研究生物过程的宝贵工具。光遗传表达系统可以利用光作为诱导剂，精确控制基因表达的时间、位置和振幅。在这个协议中，光遗传表达系统用于在斑马鱼胚胎中实现光诱导基因表达。该系统依赖于一个工程转录因子称为TAEL基于自然发生的光激活转录因子从细菌 E.利托拉利斯。当蓝光照射时，TAEL 变暗，与称为 C120 的认知调节元素结合，并激活转录。该协议使用转基因斑马鱼胚胎，表达TAEL转录因子在无处不在的 无所 不在的促进者控制下。同时，C120 调控元素驱动荧光记者基因 （GFP） 的表达。使用简单的 LED 面板提供激活蓝光，GFP 表达感应可在 30 分钟的照明后首先检测到，并在 3 小时光处理后达到 130 倍以上感应的峰值。表达感应可以通过定量实时PCR（qRT-PCR）和荧光显微镜进行评估。这种方法是一种多功能且易于使用的光遗传基因表达方法。
Introduction
诱导基因表达系统有助于控制基因表达的数量、时间和位置。然而，在多细胞生物体中实现精确的空间和时间控制是具有挑战性的。时间控制最常通过添加小分子化合物1 或激活热冲击促进剂2来实现。尽管如此，这两种方法都容易受到时间、上岗强度和偏离目标压力反应等问题的影响。空间控制主要通过使用组织特异性促进剂3来实现，但这种方法需要一个合适的促进者或调节元素，这些元素并不总是可用的，也不利于亚组织水平的诱导。
与这种传统方法相比，光激活光遗传学转录活化器具有更精细的基因表达空间和时间控制的潜力。蓝光响应TAEL/C120系统被开发和优化，用于斑马鱼胚胎5，6。该系统基于来自E.利托拉利斯7，8细菌的内源光活化转录因子。TAEL/C120 系统由称为 TAEL 的转录激活器组成，该激活器包含 Kal-TA4 转激活域、蓝光响应 LOV（光氧电压感应）域和六角形转氦 （HTH） DNA 绑定域5。照明后，LOV域经历了构象变化，允许两个TAEL分子变暗，与TAEL响应C120促进器结合，并启动下游感兴趣的基因5，8的转录。TAEL/C120 系统具有快速和坚固的感应，毒性最小，并且可以通过多种不同的送光方式激活。最近，通过向 TAEL （TAEL-N） 添加核定位信号，并将 C120 监管元素与 cFos 玄武岩促进器 （C120F） （图 1A）耦合，对 TAEL/C120 系统进行了改进。这些修改使感应水平提高了15倍以上6倍。
在此协议中，一个简单的 LED 面板用于激活 TAEL/C120 系统并诱导记者基因 GFP 的无处不在的表达。可以通过观察荧光强度或使用定量实时 PCR （qRT-PCR） 测量成绩单水平来定性地监测表达感应。该协议将证明TAEL/C120系统是一个多功能，易于使用的工具，使强大的调节基因表达 在体内。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
这项研究是经加州大学默塞德分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准进行的。
1. 斑马鱼穿越和胚胎采集
- 保持单独的转基因斑马鱼线，其中包含TAEL转录激活剂或C120控制的记者基因，以尽量减少虚假激活。
- 使用标准方法9从每条线上穿过6-8只成年斑马鱼，产生含有TAEL和C120成分的双转基因胚胎（图1B）。
注：或者，这两个组件可以通过使用标准方法10对mRNA或质粒DNA进行微注射来暂时表达。 - 在含有蛋水的培养皿中收集胚胎（60微克/mL 即时海洋盐溶解在蒸馏水中），每个条件约有30个胚胎需要测试。
- 将盘子放在防光箱中或用铝箔盖住，以尽量减少环境光线的意外激活（见表1）。
2. 全球光感应
- 使用蓝光（465 nm）LED面板同时为多个胚胎提供激活蓝光。
- 将 LED 面板相对于含有胚胎的培养皿放置，以便通过光功率和能量计（图 2A）测量，胚胎接收到的实际光功率约为1.5 mW/cm 2。
- 如果照明超过 3 小时，则使用时器继电器以 1 小时/1 小时的间隔脉冲光线，以降低对 TAEL 转录激活器5、8进行光伤害的风险。
注：可能需要针对特定应用优化照明的确切持续时间。在此协议中，提供了 30 分钟、1 小时、3 小时和 6 小时照明持续时间示例。 - 取出培养皿盖，以尽量减少凝结产生的光散射。
- 将含有控制胚胎的培养皿放在防光箱中，或用铝箔盖住，以进行深色控制。
3. qRT-PCR 对上岗的定量评估
- 在所需的激活持续时间后，从照明中取出胚胎。
- 根据试剂盒的说明，使用RNA隔离套件从30-50个光激活和30-50个深色胚胎中提取总RNA。
- 将胚胎移植到1.5mL微中心管中，并去除多余的卵水。添加裂解缓冲器，用塑料害虫使胚胎均质化。
- 将解酯转移到工具包提供的列中，并继续使用套件的说明。立即开始第 3.3 步，或将纯化RNA存储在 -20 °C 至 -80 °C。
- 使用 1 μg 总 RNA 进行 cDNA 合成，使用 cDNA 合成套件，按照套件的说明进行合成。
- 使用薄壁 0.2 mL PCR 管，将 1 μg 的 RNA 添加到 4 μL 的 5 倍 cDNA 反应主组合（包含优化缓冲、寡头 dT 和随机引物以及 dNTP）、1 μL 的 20 倍反向转录酶溶液和无核酸酶水，总体积为 20 μL。
- 将管子放在热循环器中，编程如下：22 °C 10 分钟，42 °C 30 分钟，85 °C 5 分钟，然后保持在 4 °C。 立即开始步骤 3.4 或在 -20 °C 下存储 cDNA。
- 准备含有 SYBR 绿色酶主混合物、5 倍稀释 cDNA（步骤 3.3）和 325 nM 的 QPCR 反应，用于 GFP。
注：本协议中使用的引点如下。GFP 转发： 5'-阿加卡CC-3'：GFP 反向： 5 '- Gtccccc 加特加特加特克 - 3'：ef1a 前锋 5 '- 卡卡加卡卡塔格 - 3';ef1a 反向： 5 '- 卡加加加塔克塔克塔克塔格特 - 3'） 。 - 在实时 PCR 机器中执行 qPCR 反应。
注：PCR 程序：初始激活速度为 95 °C，为 10 分钟，然后是 40 周期 30 秒，95 °C，30 秒 60 °C，1 分钟 72 °C。 - 完成 PCR 后执行熔化曲线分析，以确定反应特异性。为每个示例执行三个技术复制。
- 使用2+Ct 方法11计算光激活感应，作为相对于在黑暗中保存的胚胎的折叠变化。统计意义可以通过统计软件包确定。
4. 荧光显微镜诱导定性评估
- 在所需的激活持续时间后，从照明中取出胚胎。
- 固定胚胎，使其在玻璃抑郁症幻灯片中含有0.01%三甲基纤维素的3%中成像。
- 使用标准 GFP 滤镜设置，在连接到数码相机的荧光立体显微镜上获取荧光和亮场图像。对所有样品使用相同的图像采集设置。
- 收购后，将亮场和荧光图像与图像处理软件合并。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
对于这次演示，一条C120响应的GFP记者线（Tg（C120F：GFP）ucm107）与一条转基因线交叉，该线表示TAEL-N无处不在，来自无处不在的b（ubb：TAEL-N）促进器（Tg（ubb：TAEL-N）ucm113），以产生含有这两种元素的双转基因胚胎。24小时受精后，胚胎暴露在激活蓝光下，脉冲频率为1h/1h关闭。激活后 30 分钟、1 小时、3 小时和 6 小时（图 2B和表 1）由 qRT-PCR 量化 GFP 表达式。与控制在黑暗中的兄弟姐妹胚胎相比，在蓝光照射后30分钟就检测到了GFP表达的诱导。然后，GFP 表达水平在激活后持续增加至 6 小时。
GFP 诱导也通过检查激活后同一时间点的荧光强度（图 2C-F）进行定性评估。GFP 荧光高于背景水平首先在激活后 3 小时观察到，在激活后 6 小时时明显变亮。相比之下，所有在黑暗中保存的时间点的控制胚胎没有表现出任何明显的GFP荧光（图2G-J）。
图1：TAEL/C120功能和实验设计的原理图。（A）TAEL/C120系统由一个转录激活器组成，称为TAEL，融合到核定位信号（TAEL-N），以及一个TAEL响应调节元件，称为C120，耦合到cFos基底促进器（C120F）驱动表达感兴趣的基因。依赖 TAEL 的转录在蓝光面前很活跃，但在黑暗中不活跃。核定位信号，核定位信号。（B） 在本协议中，一条转基因线表示TAEL-N无处不在（Tg（ubb：TAEL-N），被交叉到C120驱动的GFP记者线（Tg（C120F：GFP））以产生双转基因胚胎。从 24 hpf 开始，胚胎在各种时间内暴露在激活蓝光下，最长可达 6 小时，这些插图使用基于 Web 的科学插图工具创建（参见材料表）。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：TAEL/C120光活化基因表达的代表性结果。 （A） 典型的光激活设置包括放置在孵化器中的蓝色LED光源。含有斑马鱼胚胎的培养皿相对于光源定位，因此接收的光功率约为 1.5 mW/cm2（ 点线）。在光激活过程中，将去除培养皿盖，以尽量减少光散射。（B） 在蓝光激活后，在指定时间点按 qRT-PCR 量化 GFP mRNA 水平。数据显示为 GFP 折叠感应相对于在黑暗中保存的兄弟姐妹控制胚胎。点表示生物复制（离合器）。实心水平杆表示平均值。错误条，标准偏差。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001.单向 ANOVA 确定 p 值。（C-J）代表图像显示暴露在蓝光（C-F） 或保持在黑暗中的胚胎的 GFP 荧光强度（G-J）。荧光图像（绿色）已与相应的亮场图像（灰度）：比例尺条，500μm。 请点击这里查看此图的较大版本。
| GFP 折叠感应 蓝光 （465 nm） |
GFP 折叠感应 环境光 |
||||||
| 时间照明后 | 意味 着 | 上限 | 下限 | 意味 着 | 上限 | 下限 | p 值 |
| 30分钟 | 5.363121044 | 8.15857193 | 3.525502696 | 0.661534683 | 1.097728244 | 0.398667102 | 0.005291 |
| 1 小时 | 23.44 | 46.35044081 | 11.85160592 | 2.638682529 | 4.368971424 | 1.593657823 | 0.011145 |
| 3 小时 | 48.09177693 | 71.99347359 | 32.12539822 | 8.280376038 | 24.86850106 | 2.757087255 | 0.059959 |
| 6 小时 | 131.4637117 | 163.4891638 | 105.7116392 | 16.66536842 | 27.94334716 | 9.939199585 | 0.003102 |
表1：由蓝色和环境光对照TAEL/C120诱导的表达。 在暴露在激活蓝光（465 nm）或环境光后，折叠诱导GFP mRNA水平，以指示时间，正常化以控制在黑暗中保存的兄弟姐妹胚胎。mRNA 水平由 qRT-PCR 进行量化。数据报告为平均折叠感应 +/- 上限和下限。p 值由多个 t测试确定。n = 所有时间点的 3 个离合器。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本协议描述了使用光遗传学 TAEL/C120 系统实现蓝光诱导基因表达。该系统由转录激活器 TAEL 组成，该激活器在蓝光照射下变暗，并激活 C120 调控元素下游感兴趣的基因的转录。在光照曝光后，可以检测到 GFP 记者的诱导表达，这表明此方法具有相对快速和响应灵敏的动能。
有几个因素会影响上岗水平。最关键的是激活光的波长和功率。在此协议中，使用了 465 nm LED 灯，其速度为 1.5 W/cm2。较短和较长的波长（分别为紫色和绿色光）和较低的光功率不能有效地激活表达（未显示数据）。另一方面，更多的光功率会增加胚胎光照的发生风险。因此，要成功使用 TAEL 系统，激活光必须在可见光谱的蓝色范围内 （1） 和 （2） 在足够的功率下平衡 TAEL 的有效激活和降低光破坏风险。有效的光功率可能因实验条件而异，因此可能需要进行经验确定。在激活之前，还应注意保护胚胎免受环境光的照射，环境光中含有一定量的蓝光。研究发现，TAEL/C120依赖性表达可以通过广谱环境光诱导，尽管与蓝光相比，其水平要低得多（表1）。
虽然 GFP 表达式在 30 分钟的照明后可以首先由 qPCR 检测到，但表达水平并不稳定。尽管如此，它们继续上升，直到达到3小时光处理的峰值，之后这些高表达水平保持高达6小时。这些结果表明，除了波长和光功率外，TAEL/C120 诱导的表达水平还取决于照明持续时间，至少在系统达到最大值或饱和状态之前。与这些 qPCR 结果相反，直到 3 小时的照明之后，我们才从质量上观察到可欣赏的 GFP 荧光，荧光强度在高达 6 小时的照明下继续增加。qPCR 和荧光强度观测之间的差异可能由 GFP 合成、折叠和成熟因素所需的额外时间来解释，这些时间因素可能因感兴趣的基因而异。因此，可能需要根据应用对照明持续时间进行一些优化。
该协议提出了使用蓝光 LED 面板激活 TAEL/C120 系统以照亮全球斑马鱼胚胎的最直接方法。这种方法具有使用方便和成本效益并具有优势。但是，如果需要，还可以对光激活进行空间控制。先前已证明，TAEL诱导的表达方式可以通过多种方式在空间上受到限制，以提供用户定义的、空间图案的蓝光5。使用组织特异性促进剂来调节TAEL转录激活器6的表达，可以达到额外的空间特异性。
与药物或热冲击诱导表达系统相比，光遗传表达系统可能通过使用光作为诱导剂，提供更好的空间和时间控制过度表达。除TAEL/C120外，其他光激活转录系统也已开发出12、13、14、15。然而，TAEL/C120可能特别适合在斑马鱼（以及可能的其他多细胞系统）中使用，原因有很多。首先，TAEL 转录激活器作为同质体发挥作用，从而简化了所需组件的数量。此外，包含LOV域的蛋白质，如TAEL，需要一个弗拉文染色体的光吸收16。这种共生体是内源性存在于动物细胞中，无需像其他系统一样添加外源性染色体。最后，在没有蓝光8的情况下，激活的TAEL的半衰时间预计相对较短，约为30s，从而能够更精确的开/关控制。然而，这种短暂的半衰期也意味着长期或慢性表达需要长期照明胚胎，这可能取决于情况，也可能不可取。
总之，此协议证明 TAEL/C120 系统是一种蓝光激活的基因表达系统，易于使用，具有快速响应的动能学，特别适合 在体内 应用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有宣布任何利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢斯特凡·马特纳和伍和马特纳实验室的成员对本协议的有益建议和评论。我们感谢安娜·里德、凯文·加德纳和劳拉·莫塔-梅纳在制定本协议时所做的宝贵讨论和见解。这项工作得到了国家卫生研究院（国家卫生研究院）的赠款的支持。R03 DK106358）和加州大学癌症研究协调委员会（CRN-20-636896）到S.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
References
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).
- Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
- Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).
- LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
- Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C.
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).
