Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

To-lags membran Sandwich Metode til Laodelphax striatellus Spyt Collection

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62831
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2
1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2National Plant Gene Research Center, 3University of the Chinese Academy of Sciences

Summary

Den nuværende protokol beskriver en metode til at indsamle tilstrækkeligt spyt fra piercing-sugende insekter ved hjælp af et kunstigt medium. Dette er en bekvem metode til indsamling af insekt spyt og studere spytfunktion på insekt fodring adfærd og vektorbårne virus transmission.

Abstract

Ris stribe virus (RSV), som forårsager betydelige økonomiske tab af landbrug i Østasien, helt afhænger af insekt vektorer for sin effektive transmission blandt vært ris. Laodelphax striatellus (lille brun planthopper, SBPH) er den primære insektvektor, der vandret overfører RSV, mens suger saft fra phloem. Spyt spiller en væsentlig rolle i insekternes fodringsadfærd. En bekvem metode, der vil være nyttig til forskning i insekters spyt med piercingsugende fodringsadfærd, er beskrevet her. I denne metode fik insekter lov til at fodre på en kunstig kost klemt inde mellem to strakte paraffinfilmlag. Kosten, der indeholder spyt blev indsamlet hver dag, filtreret, og koncentreret til yderligere analyse. Endelig blev kvaliteten af indsamlet spyt undersøgt af proteinfarvning og immunblæseri. Denne metode blev eksemplificeret ved at opdage tilstedeværelsen af RSV og et mucin-lignende protein i spyt af SBPH. Disse kunstige fodring og spyt indsamling metode vil lægge et fundament for yderligere forskning i faktorer i insekt spyt relateret til fodring adfærd og virus transmission.

Introduction

Risstribevirus (RSV), en negativstrenget RNA-virus i slægten Tenuivirus, forårsager alvorlige sygdomme i risproduktionen i Østasien1,2,3. Overførsel af RSV fra inficerede risplanter til sunde afhænger af insektvektorer, hovedsagelig Laodelphax striatellus, som overfører RSV på en vedvarende formeringsiv måde. SBPH erhverver virus efter fodring på RSV-inficerede planter. En gang inde i insektet inficerer RSV midgut epitelcellen en dag efter fodring og passerer derefter gennem midgutbarrieren for at trænge ind i hæmolymfen. Efterfølgende spredes RSV til forskellige væv via hæmolymfen og formerer sig derefter. Efter en latent periode på ca. 10-14 dage efter erhvervelsen kan virussen inde i spytkirtlen overføres til de sunde værtsplanter via det udskillede spyt, mens SBPH suger saft fra phloem4,5,6,7,8,9,10 . En effektiv fodringsproces og forskellige faktorer i spyt er afgørende for spredningen af RSV fra insektet til værtsplanten.

Insekt spyt udskilles af spytkirtler menes at mægle insekter, vira og værtsplanter. Hemipteran insekter normalt producere to typer spyt: gelling spyt og vandig spyt11,12,13. Gelering spyt udskilles hovedsageligt i apoplasmen for at opretholde stilens bevægelse blandt værtsceller og er også relateret til at overvinde planteresistens og immunrespons14,15,16,17. På sonderingsstadiet for fodring udskiller insekter periodisk geleringspyt, der straks bliver oxideret til at danne en overfladeflange. Derefter omslutter enkelt- eller forgrenede kapper stylet for at reservere en rørformet kanal18,19,20. Overfladen flange på epidermis formodes at lette penetration af stylet ved at tjene som et ankerpunkt, mens skeder omkring stylet kan give mekanisk stabilitet og smøring16,21,22,23. Nlshp blev identificeret som et vigtigt protein for spyt kappe dannelse og vellykket fodring af brun planthopper (Nilaparvata lugens, BPH). Hæmning af udtrykket af det strukturelle kappeprotein (SHP), der udskilles af bladlusen Acyrthosiphon pisum, reducerede reproduktionen ved at forstyrre fodring fra værtssigterør24. Desuden, i nogle insektarter, gel spyt faktorer formodes at udløse planten immunrespons ved at danne såkaldte planteæder-associerede molekylære mønstre (HAMPs). I N. lugens, NlMLP, en mucin-lignende protein relateret til kappe dannelse, inducerer planteforsvar mod fodring, herunder celledød, udtryk for forsvar-relaterede gener, og callose deposition 25,26. Også, nogle gel spyt faktorer i bladlus har vist sig at udløse planteforsvar svar via gen-til-gen interaktioner svarende til patogen-associerede molekylære mønstre12,15,27.

For at studere spytfaktorerne, der er afgørende for insektfodring og / eller patogenoverførsel, er det nødvendigt at analysere udskillet spyt. Her beskrives kunstige fodrings- og indsamlingsmetoder til at opnå tilstrækkelige mængder spyt til yderligere analyse. Ved hjælp af et medium, der kun indeholder et enkelt ernæringsmæssigt element, blev mange spytproteiner indsamlet og analyseret ved sølvfarvning og vestlig blotting. Denne metode vil være nyttig i yderligere forskning i faktorer i spyt, der er afgørende for RSV transmission af SBPH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SBPH vedligeholdelse

  1. Bag de viruliferous og RSV-fri SBPH individer i et glas inkubator (65 x 200 mm) med 5-6 ris(Oryza sativa cv. Nipponbare) frøplanter pr glaskammer i laboratoriet. Dyrk risplanterne ved 25 °C under en 16 timers lys / 8 timers mørk fotoperiode.
    BEMÆRK: De viruliferous og RSV-fri SBPH individer blev oprindeligt fanget i Jiangsu-provinsen, Kina.
  2. Detekter RSV i SBPH ved dot-enzym-forbundet immunosorbent assay (dot-ELISA) med en kanin RSV-specifikke polyklonale antistof (se Tabel over materialer)rejst mod RSV ribonucleoproteiner (RNPs).
    BEMÆRK: For at sikre høj afkom infektion effektivitet, viruliferous kvinder blev opretholdt separat, og 15% af deres afkom blev tilfældigt testet for RSV infektion. Detaljerne i dot-ELISA er beskrevet i trin 1.3-1.7.
  3. Homogeniser enkelt SBPH i 20 μL belægningsbuffer (0,05 M Na2CO3-NaHCO3, pH 9,5). Spot 3 μL af hver på nylonmembran (se Materialetabel), og tør derefter membranen ved stuetemperatur (RT).
  4. Inkuber membranen med 15 mL blokeringsbuffer (PBS + 3% skummetmælk) i 30 min ved stuetemperatur.
  5. Inkuber membranen med fortyndede primære kaninantistoffer mod RSV (1:10000) i 15 gtL PBS i 1 time ved RT og vask membranen tre gange med PBS i 5 minutters inkubation hver gang.
  6. Inkuberes membranen med 1,5 μL peberrod peroxidase-konjugeret ged anti-kanin antistoffer (se Tabellen over materialer) i 15 mL PBS og vask tre gange med PBS i 5 min inkubation hver gang.
  7. Udvikle immunoblots med Forbedret HRP-DAB Chromogenic Kit (se Tabel over materialer) i henhold til de protokoller, som producenten.

2. Forberedelse af foderkammer og kunstig kost

  1. Veje 2 g saccharosepulver og opløs det i 40 mL ddH2O for at forberede 5% saccharose vandig opløsning som den kunstige kost.
  2. Opløsningen filtreres gennem et 0,22 μm filter (se Materialetabel)for at fjerne bakterieforurening og urenheder.
  3. Sult 200 3rd-5th SBPH larver i 3-5 timer, før du introducerer dem i kammeret.
    BEMÆRK: 200 SBPH er forberedt til et kammer; mere SBPH bør forberedes til flere kamre.
  4. Glascylindrene forberedes som foderkamre (figur 1A). Dæk den ene åbne ende af kammeret med en paraffinmembran (se Materialetabel),før du introducerer de eksperimentelle insekter.
    BEMÆRK: Hver cylinder er 15,0 cm lang og 2,5 cm i diameter. Disse glascylindre er specialfremstillede i henhold til forsøgskravet.
  5. Overfør insekter til en glascylinder.
  6. Dæk den anden ende af kammeret med strakt paraffinmembran (specifikt Parafilm M). Derefter tilsættes 200 μL kunstig kost til det. Endelig dække væsken med et andet lag af strakt paraffin membran.
    BEMÆRK: Paraffinmembranen er strakt til omkring det dobbelte af det oprindelige område.
  7. Dæk kammeret med aluminiumsfolie, men lad enden med den kunstige kost enhed udsat for lyset.

3. Indsamling af SBPH spyt

  1. SBPH,der er fri for kunst, indsamles kunstig kost fra RSV-fri og viruliferous SBPH separat efter 24 timer.
  2. Cylinderen afkøles ved 4 °C for at immobilisere insekterne.
  3. Afdæk den ydre film og saml den kunstige diætvæske ved hjælp af en steril pipette i 1,5 mL sterile rør. Hold det indsamlede spyt ved -80 °C indtil analysen.
    BEMÆRK: Det indsamlede spyt kan opbevares ved -80 °C i 1 år.
  4. Skyl den indre membran med 50 μL frisk kunstig kost tre gange ved at pipettere blødt, og saml den kunstige vaskediæt som beskrevet i trin 3.3. Placer den nye kunstige kost på den indre membran og hold en frisk strakt paraffinmembran ovenpå.
  5. Gentag trin 3.2 og 3.3 i 5 dage til 2 uger.
    BEMÆRK: Tæl overlevelsesraten for kunstig fodring SBPH og sørg for tilstrækkelig tilskud af frisk SBPH i henhold til overlevelsesraten.
  6. De indsamlede prøver filtreres gennem en 0,22 μm filterenhed for at fjerne mikrober og andre forurenende stoffer.

4. Koncentration af det indsamlede spyt

  1. De indsamlede spytprøver overføres i et 0,5 mL 10 kD centrifugalfilter (se Materialetabel)og spin ved 5.500 x g ved 4 °C i 20 min. Saml supernatanten og gør det endelige volumen til 100 μL.
  2. Koncentrationen af det indsamlede spyt måles ved hjælp af et passende UV-Vis-spektrofotometer efter trin 4.3-4.6.
  3. Tænd for spektrofotometeret, og vask piedestalerne tre gange med ddH2O.
  4. Vælg følgende indstillinger på skærmen i korrekt rækkefølge: Proteiner | Protein A280 | Vælg | 1 Abs = 1 mg/mL. Marker derefter afkrydsningsfeltet Oprindelig rettelse 340 nm.
  5. Læg 2 μL 5% saccharose vandig opløsning som tom, tryk på Blank nederst på skærmen.
  6. Når du har fastsat standarder, skal du indlæse 2 μL af det indsamlede spyt til måling. Læs og registrer proteinkoncentrationen.
    BEMÆRK: 1 mg spytproteiner blev endelig indsamlet i alt i det mindste.

5. Sølvfarvning af spytproteiner

  1. Ekstrakt protein fra insekt spyt prøver ved hjælp af prøve lastning buffer (50 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% glycerol, 2% SDS, 0,1% bromophenol blå, og 1% β-mercaptoethanol). Derefter fraktionere det med 10% SDS-PAGE (se Tabel over materialer). Læg den 5% sucroseaqueous opløsning behandlet på samme måde som en negativ kontrol.
  2. Prøvens 20 μL-aliquot på en SDS-PAGE gel ved siden af en påbeholdt markør. Kør gelen i 15 min ved 90 Volt, og derefter 50 min ved 140 Volt.
  3. Fastgør gelen i 30% (vol/vol) ethanol, 10% (vol/vol) eddikesyre i mindst 30 min efter elektroforese.
  4. Skyl gelen to gange med 20% (vol/vol) ethanol og vand separat i 10 min hver gang.
  5. Sensibilisere gelen i 0,8 mM natrium thiosulat i 1 min, og derefter skylles to gange i vand i 1 min hver gang.
  6. Fordyb gelen i 12 mM sølvnitrat i mindst 1 time, og dyp den derefter i deioniseret vand i 10 s, før du overfører den til udvikleropløsningen.
  7. Når gelens baggrund bliver mørk, nedsænkes gelen i en stopopløsning (5% eddikesyre) i mindst 30 minutter for at stoppe reaktionen.
  8. Vask gelen to gange med vand i 30 minutter hver gang. Udvikle afbildningen med detektionssystemet (se Materialetabel).

6. Proteindetektering ved vestlig blotting

  1. Detekter spyt mucin-lignende protein af SBPH (LssgMP) og RSV af vestlige blotter ved hjælp af specifikke antistoffer, henholdsvis.
  2. Prøve af insekt spytprøver efter trin 5.1.
  3. Læg en 20 μL aliquot af prøven på en 10% SDS-PAGE gel sammen med en præseficeret markør og en 20 μL RSV ikke-inficeret spytprøve som en negativ kontrol. Kør gelen i 15 min ved 90 Volt, og derefter i 50 min ved 140 Volt.
  4. Bland 100 mL 10x proteinoverførselsbuffer (våd) (se Materialetabel) med 900 mL ddH2O til en arbejdsopløsning (1x), og overfør derefter proteiner til en polyvinyliden difluoridmembran ved hjælp af proteinoverførselsbuffer (1x).
  5. Bloker membranen i 5% skummetmælk med 0,01 M Tris-buffered saltvand med 0,05% Tween 20 (TBST) ved stuetemperatur (RT) i 1 time.
    BEMÆRK: I denne protokol blandes 100 mL 10x TBST (se Materialetabel) med 900 mL ddH2O i arbejdsløsningen.
  6. Inkuberes membranen med primære kaninantistoffer mod RSV eller LssgMP (begge 1:10000), fortyndet i TBST ved RT i mindst 2 timer.
    BEMÆRK: Produktionen af primære antistoffer mod RSV blev nævnt ovenfor. En bioteknologisk virksomhed produceret kanin anti-LssgMP polyklonale antistof mod LssgMP peptid GIQFDSYSASDLTRC.
  7. Vask membranen tre gange med TBST i 10 minutters inkubation hver gang.
  8. Inkubere membranen med peberrod peroxidase-konjugeret ged anti-kanin antistoffer fortyndet i 1:10000 TBST.
  9. Udvikle immunoblots med den forbedrede chemiluminescens Vestlige Blotting Detection System.

7. Påvisning af LssgMP-udtryksmønster i SBPH

  1. Immobiliser insekterne ved 4 °C i 5 min.
  2. Vask insekterne med 75% ethanol og ddH2O en efter en, og disseker derefter insekterne i prækølet TBS (0,01 M Tris-buffered saltvand).
  3. Dissekere insekterne fra maven, mens du afskærer forbenene af SBPH på coxa-trochanter fælles ved kraft; vaske midgut og spytkirtler to gange i TBS at fjerne enhver forurening fra hæmolymfen.
  4. Sæt fem væv i et 1,5 mL RNase-fri rør for at udtrække RNA. Overvej hvert rør som en prøve.
  5. Udfør RNA-udvinding i henhold til producentens protokoller og Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) (se Materialetabel).
  6. Udfør kvantitative real-time PCR (qRT-PCR) for at undersøge den relative udskrift udtryk niveauer af LssgMP i ekstrakter af hele kroppen eller forskellige væv af L. striatellus.
    BEMÆRK: De primerpar, der blev brugt til genforstærkning, var LssgMP-q-F/LssgMP-q-R, SYBR Green-baserede qPCR blev udført i henhold til producentens protokol. Udskriftsniveauet for L. striatellus oversættelsesforlængelsesfaktor 2 (ef2) blev kvantificeret med primerparret ef2-q-F/ef2-q-R til normalisering af cDNA-skabelonerne. Og primer sekvenser er knyttet nedenfor:LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R: GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC; ef2-q-F: GTCTCCACGGATGGGCTTT; ef2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Skemaer for kunstig fodring installation og spyt indsamling
Figur 1A skildrer glascylinderen (15 cm x 2,5 cm), der bruges som foderkammer til at opsamle spyt. For det første blev SBPH larverne sultet i flere timer for at forbedre indsamlingseffektiviteten og derefter immobiliseret ved at køle i 5 minutter. Efter at insekterne blev overført til glascylinderen, blev begge åbne ender af kammeret dækket af strakt paraffinmembran. I den ene ende blev 200 μL 5% saccharose klemt inde mellem to lag paraffinmembran, der blev udvidet til ca. det dobbelte af det oprindelige areal (figur 1B). Kammeret var dækket af folie, men enden med den kunstige kost blev udsat for lys. Fordi SBPH viser fototropisk adfærd, blev de udsultede insekter, der var samlet i slutningen, udsat for lys og fodret med den kunstige kostopløsning gennem den strakte indre paraffinmembran. Baseret på det kunne spyt frigives til den kunstige kost, som blev indsamlet hver dag. Parafilm-diætenheden blev erstattet med en ny hver dag. På denne måde blev den kunstige kost indsamlet i 5 dage til 2 uger, og derefter blev hele prøven koncentreret til et endeligt volumen på 100 μL ved hjælp af et 10 KD centrifugalfilter (Figur 1C). Under indsamlingen af spyt blev overlevelsesraten for SBPH fodring af 5% saccharose talt. I de første 4 dage overlevede mere end 80% SBPH. Men fra den5. dag og fremefter steg dødeligheden hurtigt til 40%, og mindre end halvdelen af SBPH overlevede den7. dag (figur 1D). For at indsamle tilstrækkeligt spyt blev frisk SBPH foreslået at levere på den4. dag.

Verifikation af indsamlede spytproteiner
Til vurdering af effektiviteten af denne indsamlingsmetode blev spytprøven udsat for proteinanalyse. For det første blev proteiner adskilt af SDS-PAGE, og derefter detekteret af sølvfarvning (Figur 2A). Sammenlignet med den negative kontrol (5% saccharose) indeholdt de koncentrerede spytprøver fra RSV-inficeret SBPH spyt mange proteiner, der kunne analyseres yderligere, for eksempel ved massespektrometri. Som den primære insektvektor for RSV overfører SBPH virussen til planter via sin sugepiercing-piercing fodringsproces. Den vellykkede frigivelse af RSV er relateret til spyt sekretion, og RSV anses for at være en væsentlig faktor i viruliferous insekter spyt. Her blev spyt testet efter indsamling af ikke-inficerede og viruliferøse insekter med et antistof mod RSV og med succes opdaget RSV-frakkeproteinet (CP) i den viruliferøse prøve (Figur 2B). En anden undersøgelse viste, at mucinproteiner er essentielle gelspytproteiner i hemipteraninsekter for at meditere dannelsen af en kappe til fodringaf 23. For at bekræfte, at SBPH også producerer et mucinprotein, blev hele den åbne læseramme af et putativt mucin-kodningsgen forstærket af RNA udvundet fra spytkirtlen på SBPH. Dens sekvens blev brugt som en forespørgsel i BLAST analyser mod genom sekvens af SBPH28. Et gen bestående af 2175 bp, kaldet LssgMP, blev identificeret. Et antistof mod dette protein blev tidligere fremstillet og blev brugt til at detektere proteinet i den indsamlede prøve ved western blot-analyse. Et 78 KD-protein blev påvist i ikke-inficerede og viruliferøse prøver, hvilket viser, at LssgMP er et spytprotein (Figur 2C). Dernæst blev udskriftsniveauerne af LssgMP i forskellige væv (spytkirtel, tarm og resterende krop) bestemt af qRT-PCR. Resultaterne viste, at genudskriftsniveauet var 20 gange højere i spytkirtlen end i tarmen og andre kropsdele (Figur 2D), hvilket bekræftede det specifikke udtryk for LssgMP i spytkirtlen.

Figure 1
Figur 1: Diagram over foderkammer med paraffinmembransandwich, der gør det muligt at fodre SBPH på kunstig kost. (A) Illustration af kunstigt foderkammer. Cylinderen er 15,0 cm lang og 2,5 cm i diameter. I den ene ende af kammeret er Paraffin membran sandwich; den anden ende og cylindervæggen, der er dækket af sølvpapir (skrå linjer), repræsenterer den enhed, der er dækket af sølvpapir. Lyskilden var indstillet til at tiltrække SBPH til at fodre på den kunstige kost. (B) Diagram over paraffinsandwich indeholdende kunstig kost. 200 μL af 5% saccharose vandig opløsning blev klemt inde mellem to lag paraffinmembraner strakt til omkring det dobbelte af det oprindelige areal. (C) Koncentrationen af opsamlet spyt ved hjælp af et 10 KD centrifugalfilter. (D) Overlevelsesraten for SBPH fodring på 5% saccharose. Middel- og SEM blev beregnet ud fra fire biologiske kopier med tre tekniske kopier. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Verifikation af indsamlede spytproteiner. (A) Spytproteiner detektering ved sølv farvning. De 5% saccharose er negativ kontrol. (B) Påvisning af ris stribe virus frakke protein (CP) i indsamlet spyt ved western blot analyse. (C) Vestlige blotting at bekræfte tilstedeværelsen af LssgMP i indsamlet spyt. (D) Specifikt udtryk for LssgMP i spytkirtlen i L. striatellus. ef2: oversættelsesforlængelsesfaktor 2 i SBPH. Middel- og SEM blev beregnet ud fra fire biologiske kopier med tre tekniske kopier. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vellykket opdræt af insekter på kunstig kost blev først rapporteret i 1962, da Mittler og Dadd beskrev Paraffin membran teknik til at holde en kunstig kost29,30. Og denne metode er blevet udforsket i mange aspekter af insektbiologi og adfærd, for eksempel næringsstoftilskud, dsRNA fodring og virusopsamling. Baseret på kravene til spytanalyse anvendes 5% saccharose som den generelle kunstige kost til at indsamle spyt af SBPH i denne undersøgelse. For vellykket spytsamling er flere kritiske trin værd at bemærke her. For det første er det nødvendigt at sulte de eksperimentelle insekter, før de introduceres i kammeret for at sikre effektiviteten af spytsamlingen. For det andet, for at efterligne stylet miljøet, er en to-lags paraffin sandwich lavet. Når SBPH føder på den kunstige kost, danner spytskeden i den indvendige ende, der vender mod kosten, og det vandige spyt udskilles efterfølgende. For det tredje bør der indsamles og udveksles et kunstigt medium i tide for at reducere mikrobiel kontaminering i den indsamlede prøve. Endelig er bedøvelse af insekterne ved 4 °C i 5 min afgørende for at undgå tab af insekter, mens den kunstige kost ændres.

I modsætning til de fleste kunstige kostvaner, der indeholder aminosyrer, vitaminer og kulhydrater, fordelene ved 5% saccharose medium er bemærkelsesværdige. For det første er det let at forberede. For det andet betyder kostens enkle sammensætning få stoffer til at forstyrre yderligere analyse af de forskellige faktorer i spyt. Ikke desto mindre faldt overlevelsesforholdet for SBPH i de sidste dage af fodringsperioden ved hjælp af 5% saccharose som den generelle kunstige kost (Figur 1D). For at overvinde denne fejl, bør frisk SBPH leveres i tide til nok spyt. Og for yderligere forskning i spytfunktionen på fodringsadfærd eller virusoverførsel bør spytopsamlingsvarigheden begrænses til den nøjagtige tid, før insekternes dødelighed steg på grund af insintrition. Det synes at være en fælles begrænsning af det kunstige medium. Nogle andre undersøgelser viste, at overlevelsen af N. lugens opdrættet på den kemisk definerede kost D-97 var ringere end dem, der er rejst på den modtagelige ris sort TN1, hvilket indebærer, at den oprindelige vært leverer mere end blot mad vektor insekter. Og flere undersøgelser har fokuseret på at optimere kemisk definerede kostvaner til kontinuerlig fodring af insekter for at forbedre opdrætseffektiviteten.

Transcriptome analyse af spytkirtlen er en traditionel metode til identifikation af spytprotein. Og forskellige spytproteiner er blevet påvist i samme art af A. pisum og M. persicae14,31, og overfloden af spytproteiner bestemmer hyppigheden af deres påvisning32. Men en gyldig metode til at undersøge det formodede protein i spyt manglede. Denne Paraffin membran sandwich metode giver en innovativ måde at bekræfte en formodet spyt protein identificeret ved transcriptom analyse, som yderligere bevises ved at opdage LssgMP (Figur 2C). Desuden bekræftede proteinanalyse, at der findes rigelige proteiner i det indsamlede spyt (Figur 2A), hvilket er en tilstrækkelig mængde til yderligere analyse af for eksempel massespektrometri. Proteomics analyse af indsamlet spyt vil være en direkte og effektiv metode til at identificere udskillede faktorer, der er involveret i fodringsfasen af SBPH, hvilket minimerer risikoen for at opdage falsk-positive overflødige proteiner.

Spyt fungerer som virusbærer fra insekt til værtsplanter og er en væsentlig del af vektorvirus-planteinteraktionen14,33,34. Titeren af virus frigivet fra insektvektorer er en afgørende faktor for infektionen til værten. Sammenlignet med indirekte metoder, der tester virus titer i inficerede planter, kan denne protokol direkte opdage RSV frigivet af viruliferous SBPH (Figur 2B). Understøttet af denne Paraffin membran sandwich metode, yderligere sammenlignende analyser af spyt proteiner indsamlet fra RSV-fri og RSV-inficerede insekter kan også afsløre potentielle kandidater involveret i virus-plante-vektor interaktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Key Research and Development Program of China (nr. 2019YFC1200503), af National Science Foundation of China (Nr. 32072385) og af Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-KD centrifugal filter Merck Millipore R5PA83496 For concentration
10x Protein Transfer Buffer(wet) macGENE MP008 Transfer buffer for western blotting
10x TBST buffer Coolaber SL1328-500mL×10 Wash buffer for western blotting
Azure c600 biosystems Azure Biosystems Azure c600 Imaging system for western blotting and silver staining
Color Prestained protein ladder GenStar M221-01 Protein marker for western blotting
ECL western blotting detection reagents GE Healthcare RPN2209 Western blotting detection
Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit TIANGEN #PA110 Chromogenic reaction
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies Sigma 401393-2ML Polyclonal secondary antibody for western blotting
Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane Merck Millipore IPVH00010 Transfer membrane for western blotting
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725125 For quantitative real-time PCR (qRT-PCR)
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES Bio-Rad 1708891 For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR)
Millex-GP Filter, 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RB For filtration
Mini-PROTEAB TGX Gels Bio-Rad 4561043 For SDS-PAGE
NanoDrop One Thermo Scientific ND-ONEC-W Detection of protein concentration
Nylon membrane PALL T42754 Membrane for dot-ELISA
Parafilm M Membrane Sigma P7793-1EA Making artifical diet sandwichs
Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides Genstript Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting
Rabbit anti-RSV polyclonal antibody Genstript Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA
RNAprep pure Micro Kit TIANGEN DP420 For RNA Extraction

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
  2. Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Virus. The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).
  3. He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. Evolution of rice stripe virus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).
  4. Wu, W., et al. Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects. PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).
  5. Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).
  6. Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence. Scientific Reports. 6, 38082 (2016).
  7. Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
  8. Huo, Y., et al. Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus. Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).
  9. Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
  10. Huo, Y., et al. Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).
  11. Bao, Y. Y., et al. De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response. Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).
  12. Elzinga, D. A., Jander, G. The role of protein effectors in plant-aphid interactions. Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).
  13. Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).
  14. Bos, J. I., et al. A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid). PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).
  15. Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach. Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).
  16. Cao, T. T., Lü, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion. Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).
  17. De Vos, M., Jander, G. Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell & Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).
  18. Wang, L., et al. Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera. Scientific Reports. 6, 36254 (2016).
  19. Wang, Y., et al. Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths. Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).
  20. Wang, W., et al. Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).
  21. Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).
  22. Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).
  23. Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. Clock genes show circadian rhythms in salivary glands. Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).
  24. Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).
  25. Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation. Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).
  26. Shangguan, X., et al. A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants. Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).
  27. Petrova, A., Smith, C. M. Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa. Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).
  28. Zhu, J., et al. Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus. GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).
  29. Van Bel, A. J., Will, T. Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids. Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).
  30. Perez-Vilar, J., Hill, R. L. The structure and assembly of secreted mucins. The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).
  31. Pitino, M., Hogenhout, S. A. Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).
  32. Zhang, F., Zhu, L., He, G. Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice. Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).
  33. Hogenhout, S. A., Ammar, E. -D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  34. Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects. Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).

Tags

Biologi udgave 174
To-lags membran Sandwich Metode til <em>Laodelphax striatellus</em> Spyt Collection
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, … More

Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, R., Huo, Y. Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection. J. Vis. Exp. (174), e62831, doi:10.3791/62831 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter