Zweischichtige Membran-Sandwich-Methode für Laodelphax striatellus Speichelsammlung
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode, um mit einem künstlichen Medium ausreichend Speichel von piercing-saugenden Insekten zu sammeln. Dies ist eine bequeme Methode, um Insektenspeichel zu sammeln und die Speichelfunktion auf das Fressverhalten von Insekten und die Übertragung von vektorübertragenen Viren zu untersuchen.
Abstract
Das Reisstreifenvirus (RSV), das in Ostasien zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten der Landwirtschaft führt, hängt für seine effektive Übertragung unter wirtseigenem Reis vollständig von Insektenvektoren ab. Laodelphax striatellus (Kleine braune Zwergzikade, SBPH) ist der primäre Insektenvektor, der RSV horizontal überträgt, während er Saft aus dem Phloem saugt. Speichel spielt eine bedeutende Rolle im Fressverhalten von Insekten. Eine praktische Methode, die für die Erforschung des Speichels von Insekten mit piercing-saugendem Fressverhalten nützlich sein wird, wird hier beschrieben. Bei dieser Methode durften sich Insekten von einer künstlichen Diät ernähren, die zwischen zwei gestreckten Paraffinfilmschichten eingeklemmt war. Die Diät, die den Speichel enthielt, wurde jeden Tag gesammelt, filtriert und für weitere Analysen konzentriert. Schließlich wurde die Qualität des gesammelten Speichels durch Proteinfärbung und Immunoblotting untersucht. Diese Methode wurde durch den Nachweis von RSV und einem Mucin-ähnlichen Protein im Speichel von SBPH veranschaulicht. Diese künstliche Fütterungs- und Speichelsammelmethode wird eine Grundlage für die weitere Erforschung von Faktoren im Speichel von Insekten im Zusammenhang mit dem Fressverhalten und der Virusübertragung bilden.
Introduction
Reisstreifenvirus (RSV), ein negativ gestrandetes RNA-Virus der Gattung Tenuivirus,verursacht schwere Erkrankungen in der Reisproduktion in Ostasien1,2,3. Die Übertragung von RSV von infizierten Reispflanzen auf gesunde pflanzen hängt von Insektenvektoren ab, hauptsächlich Laodelphax striatellus, die RSV persistent-propagierend übertragen. SBPH erwirbt das Virus nach der Fütterung von RSV-infizierten Pflanzen. Einmal im Inneren des Insekts infiziert RSV einen Tag nach der Fütterung die Mitteldarmepithelzelle und passiert dann die Mitteldarmbarriere, um die Hämolymphe zu durchdringen. Anschließend breitet sich RSV über die Hämolymphe in verschiedene Gewebe aus und vermehrt sich dann. Nach einer Latenzzeit von etwa 10-14 Tagen nach dem Erwerb kann das Virus in der Speicheldrüse über den sezernierten Speichel auf die gesunden Wirtspflanzen übertragen werden, während SBPH Saft aus dem Phloemsaugt 4,5,6,7,8,9,10 . Ein effizienter Fütterungsprozess und verschiedene Faktoren im Speichel sind für die Ausbreitung von RSV vom Insekt auf die Wirtspflanze unerlässlich.
Es wird angenommen, dass Insektenspeichel, der von Speicheldrüsen abgesondert wird, Insekten, Viren und Wirtspflanzen vermittelt. Hemiptera-Insekten produzieren normalerweise zwei Arten von Speichel: gelierenden Speichel und wässrigen Speichel11,12,13. Gelierender Speichel wird hauptsächlich in das Apoplasma ausgeschieden, um die Bewegung des Stylets zwischen den Wirtszellen aufrechtzuerhalten, und ist auch mit der Überwindung der Pflanzenresistenz und der Immunantworten verbunden14,15,16,17. In der Sondierungsphase der Fütterung sezernieren Insekten intermittieren sie gelierenden Speichel, der sofort oxidiert wird, um einen Oberflächenflansch zu bilden. Dann umschließen einzelne oder verzweigte Hüllen den Stylet, um einen röhrenförmigen Kanal18,19,20zu reservieren. Es wird angenommen, dass der Oberflächenflansch an der Epidermis das Eindringen in den Stylet erleichtert, indem er als Ankerpunkt dient, während die Ummantelungen um den Stylet mechanische Stabilität und Schmierung bieten können16,21,22,23. Nlshp wurde als essentielles Protein für die Speichelscheidenbildung und die erfolgreiche Fütterung der braunen Zwergzikade(Nilaparvata lugens,BPH) identifiziert. Die Hemmung der Expression des strukturellen Mantelproteins (SHP), das von der Blattlaus Acyrthosiphon pisum sezerniert wird, reduzierte seine Fortpflanzung, indem die Fütterung aus wirtsiebröhren unterbrochen wurde24. Darüber hinaus sollen Gelspeichelfaktoren bei einigen Insektenarten pflanzliche Immunantworten auslösen, indem sie sogenannte Pflanzenfresser-assoziierte molekulare Muster (HAMPs) bilden. In N. lugensinduziert NlMLP, ein Mucin-ähnliches Protein, das mit der Scheidenbildung zusammenhängt, pflanzliche Abwehrkräfte gegen die Fütterung, einschließlich Zelltod, die Expression von verteidigungsbezogenen Genen und Kallosettenablagerung 25,26. Es wurde auch nachgewiesen, dass einige Gelspeichelfaktoren bei Blattläusen pflanzenabwehrreaktionen über Gen-zu-Gen-Interaktionen ähnlich den pathogenassoziierten molekularen Musternauslösen 12,15,27.
Für die Untersuchung der Speichelfaktoren, die für die Fütterung von Insekten und / oder die Übertragung von Krankheitserregern unerlässlich sind, ist es notwendig, den sekretierten Speichel zu analysieren. Hier werden künstliche Fütterungs- und Entnahmemethoden beschrieben, um ausreichende Mengen an Speichel für die weitere Analyse zu erhalten. Mit einem Medium, das nur ein einziges Nährstoff enthielt, wurden viele Speichelproteine gesammelt und durch Silberfärbung und Western Blotting analysiert. Diese Methode wird bei der weiteren Erforschung von Faktoren im Speichel hilfreich sein, die für die RSV-Übertragung durch SBPH unerlässlich sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die erfolgreiche Aufzucht von Insekten auf künstlicher Diät wurde erstmals 1962 berichtet, als Mittler und Dadd die Paraffinmembrantechnik zur Durchführung einer künstlichen Diät beschrieben29,30. Und diese Methode wurde in vielen Aspekten der Insektenbiologie und des Verhaltens erforscht, zum Beispiel in den Bereichen Nahrungsergänzungsmittel, dsRNA-Fütterung und Virusakquisition. Basierend auf den Anforderungen der Speichelanalyse wird in dieser Studie 5…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Key Research and Development Program of China (Nr. 2019YFC1200503), von der National Science Foundation of China (Nr. 32072385) und von der Youth Innovation Promotion Association CAS (2021084) unterstützt.
Materials
| 10-KD centrifugal filter | Merck Millipore | R5PA83496 | For concentration |
| 10x Protein Transfer Buffer(wet) | macGENE | MP008 | Transfer buffer for western blotting |
| 10x TBST buffer | Coolaber | SL1328-500mL×10 | Wash buffer for western blotting |
| Azure c600 biosystems | Azure Biosystems | Azure c600 | Imaging system for western blotting and silver staining |
| Color Prestained protein ladder | GenStar | M221-01 | Protein marker for western blotting |
| ECL western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | Western blotting detection |
| Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit | TIANGEN | #PA110 | Chromogenic reaction |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies | Sigma | 401393-2ML | Polyclonal secondary antibody for western blotting |
| Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | Transfer membrane for western blotting |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725125 | For quantitative real-time PCR (qRT-PCR) |
| KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES | Bio-Rad | 1708891 | For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR) |
| Millex-GP Filter, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RB | For filtration |
| Mini-PROTEAB TGX Gels | Bio-Rad | 4561043 | For SDS-PAGE |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | Detection of protein concentration |
| Nylon membrane | PALL | T42754 | Membrane for dot-ELISA |
| Parafilm M Membrane | Sigma | P7793-1EA | Making artifical diet sandwichs |
| Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides | Genstript | Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting | |
| Rabbit anti-RSV polyclonal antibody | Genstript | Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA | |
| RNAprep pure Micro Kit | TIANGEN | DP420 | For RNA Extraction |
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