Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von Neutrophilen aus Vollblut, Buffy Coats oder Leukapheresemembranen, um eine gute Ausbeute, hohe Reinheit und minimale Zellaktivierung zu erreichen. Wir verwenden Gradientenreinigung, Sedimentation der roten Blutkörperchen (RBC) und RBC-Lyse, um ein hochwertiges / reines Neutrophilenpräparat zu erhalten.
Neutrophile (PMNs) sind die am häufigsten vorkommenden Leukozyten im menschlichen Kreislauf und reichen von 40 bis 70% der gesamten Blutleukozyten. Sie sind die ersten Zellen, die am Ort der Entzündung durch schnelle Extravasation durch Gefäße rekrutiert werden. Dort führen Neutrophile eine Reihe von Funktionen aus, um eindringende Krankheitserreger abzutöten und Immunsignale zu vermitteln. Frisch gereinigte Neutrophile aus menschlichem Blut sind das Modell der Wahl für Studien, da keine Zelllinie die PMN-Funktionen und die Biologie vollständig repliziert. Neutrophile sind jedoch kurzlebige, endständig differenzierte Zellen und sehr anfällig für die Aktivierung als Reaktion auf physikalische (Temperatur, Zentrifugationsgeschwindigkeit) und biologische (Endotoxin, Chemo- und Zytokine) Reize. Daher ist es wichtig, einer standardisierten, zuverlässigen und schnellen Methode zu folgen, um reine und nicht aktivierte Zellen zu erhalten. Dieses Protokoll stellt ein aktualisiertes Protokoll dar, das Dichtegradientenzentrifugation, Sedimentation der roten Blutkörperchen (RBC) und RBC-Lyse kombiniert, um eine hohe PMN-Reinheit zu erreichen und die Zellaktivierung zu minimieren. Darüber hinaus werden auch Methoden zur Beurteilung der Qualität, Lebensfähigkeit und Reinheit der Neutrophilisolierung diskutiert.
Das angeborene Immunsystem besteht aus vielen Zelltypen, die die Immunhomöostase und pathogene Clearance zusammen mit vielen anderen physiologischen Funktionen aufrechterhalten. Neutrophile bilden den größten Pool weißer Blutkörperchen im menschlichen Kreislauf1. Die meisten reifen Neutrophilen werden im Knochenmark gespeichert, dem Ort der Entstehung neuer Neutrophilen, auch Granulopoese genannt. Im Knochenmark verlassen Granulozytenvorläufer den Zellzyklus und differenzieren sich terminal, wobei sie ihre charakteristischen segmentierten Kerne und Granula erwerben2. Unter entzündlichen Bedingungen werden Neutrophile als Reaktion auf Chemokine, Zytokine und schadensassoziierte und pathogenassoziierte molekulare Muster aus dem Blutkreislauf und aus dem Knochenmark mobilisiert, um eine Vielzahl von Funktionen auszuführen. Dazu gehören die Zytokinsekretion, die direkte Phagozytose des Erregers, die Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies, die Degranulation antimikrobieller Proteine und die Bildung neutrophiler extrazellulärer Fallen.
Die Moleküle, die von Neutrophilen zur Bekämpfung von Infektionen verwendet werden, sind für die Mikroben und den Wirt toxisch. So sind die Lebensdauer und die richtige Entfernung von alternden / sterbenden Neutrophilen stark reguliert, und sie haben eine begrenzte Lebensdauer im Kreislauf (<48 h)3. Aufgrund dieses kurzen Überlebens produziert der menschliche Körper jeden Tag durchschnittlich 100 Milliarden neue Neutrophile, um die Homöostase der Bevölkerung aufrechtzuerhalten4. Notfall-Granulopoese kann die Freisetzung von Neutrophilen, sowohl reifen als auch unreifen, im Blut während Entzündungen und Infektionen weiter erhöhen5. Die Bedeutung von Neutrophilen in der angeborenen Immunantwort wird von Patienten mit erworbener oder angeborener Neutropenie hervorgehoben, die anfällig für bakterielle und Pilzinfektionen sind6.
Viele Herausforderungen ergeben sich beim Studium der Neutrophilenbiologie und ihrer Rolle in der Immunantwort aufgrund ihrer Natur, einschließlich ihres kurzen Überlebens und ihres zytotoxischen Gehalts. Neutrophilenähnliche Zelllinien wurden üblicherweise von humanen promyelozytären Leukämie-HL-60-Zellen und PLB-985-Zellenunterschieden 7,8. Obwohl sie eine neutrophilenartige Morphologie aufweisen und chemotaxis durchführen können, können diese Zelllinien die Biologie der Neutrophilen nicht vollständig rekapitulieren. In-vitro-Assays, die diese Zelllinien verwenden, sind auch nicht in der Lage, In-vivo-Experimente zu rekapitulieren. Darüber hinaus muss die Differenzierung dieser Zellen induziert werden und könnte durch Genmanipulation vor der Differenzierung beeinträchtigt werden.
In jüngster Zeit wurden Methoden entwickelt, um diese Probleme zu umgehen, indem induzierbare Promotoren verwendet werden, um die Genexpression nach der Differenzierung in HL-60-Zellen zu modulieren9. Selbst mit solchen Werkzeugen sind primäre menschliche PMNs erforderlich, um Ziele mit pharmakologischen Ansätzen zu validieren. Daher ist es unerlässlich, reine und inaktivierte Neutrophile zu erhalten, die aus Blut isoliert wurden, um die Ergebnisse von Zelllinien- und Tiermodellen zu validieren. Dieser Beitrag stellt ein überarbeitetes PMN-Isolationsprotokoll vor, in dem die Vor- und Nachteile aktueller Methoden bewertet wurden10. Es wurde eine Kombination entwickelt, die aus Gradientenzentrifugation zur Trennung von PMNs von anderen Immunzellen, kurzer Dextran-basierter Sedimentation zur Entfernung des Großteils der Erythrozyten, schneller Rest-Erythrozyten-Lyse über osmotischen Druck und Low-Speed-Zentrifugation zur Entfernung von Thrombozytenkontamination besteht.
Aufgrund der kurzen Lebensdauer, des terminalen Differenzierungsstatus und des lytischen Gehalts von Neutrophilen war die Untersuchung dieser Zellen schon immer eine Herausforderung. Neben der Verwendung von Mausmodellen oder Zellen aus Patientenkohorten sind Zelllinien nützliche Werkzeuge, um die Neutrophilenbiologie zuuntersuchen 16. Neutrophilenähnliche Zelllinien können jedoch nicht alle Aspekte der Neutrophilenbiologie vollständig wiederholen, was eine zusätzliche Schwierigkeitsschicht bei der Untersuchung dieser Zellen hinzufügt. Das am häufigsten verwendete In-vitro-Modell ist die HL-60-Zelllinie, die durch Behandlung mit Dimethylsulfoxid oder Retinsäure in neutrophile Zellen differenziert werden kann17,18. Obwohl diese Zellen bei der Untersuchung von Migration und Atemausbrüchen nützlich sind, sind sie nicht geeignet, um die mikrobiozide Aktivität von Neutrophilen zu untersuchen. Es gibt andere Zelllinien (PLB-98, NB4), und sie sind auch mit ihren Einschränkungen verbunden19.
Es ist von entscheidender Bedeutung, Beobachtungen mit primären humanen Neutrophilen zu validieren, die mit Mauskrankheitsmodellen und Zelllinien gemacht wurden. Neutrophile können nicht effizient kryokonserviert werden und werden daher oft frisch aus Vollblut- oder Buffy-Mänteln isoliert, die von Spendern gewonnen und sofort verarbeitet werden. Einmal isoliert, beginnen die Zellen eine komplexe Form des spontanen Todes zu durchlaufen, reguliert durch Oxidation, zytoplasmatische Caspasen und Proteasen, die in neutrophilen Granula gefunden werden20,21. Unsachgemäße Isolationsmethoden oder -techniken können zur Aktivierung von Neutrophilen führen und nur den Zelltod beschleunigen. Es ist unerlässlich, eine zuverlässige und konsistente Methode zu haben, um reine und qualitativ hochwertige Neutrophile von Spendern zu erhalten.
Es wurden viele Methoden zur Isolierung menschlicher Neutrophilen veröffentlicht10,22. Sie fallen hauptsächlich in zwei Kategorien, mit einigen gemeinsamen Strategien. Die erste Kategorie ist Antikörper-basiert, entweder durch positive oder negative Selektion. Eine positive Selektion würde Neutrophile direkt markieren und somit eine hochreine Zellpopulation liefern, obwohl sie auch zu einer schnellen Zellaktivierung, zum Zelltod sowie zur unerwünschten Markierung von Neutrophilen führt23. Negative Selektion, obwohl die Zellen nicht markiert und eine sehr reine Population ergebend, beschleunigte den Tod von Neutrophilen, obwohl der genaue Mechanismus unbekannt ist (Abbildung 5). Ob die Gen- oder Proteinexpression auch nach positiver oder negativer Selektion verändert ist, muss weiter untersucht werden. Darüber hinaus können diese Methoden aufgrund der Menge an Antikörpern, die benötigt werden, um die anderen Zelltypen zu erschöpfen, keine großen Mengen an Neutrophilen ausgeben. Antikörper-basierte Assays können jedoch immer noch für Kurzzeitkulturen und Experimente in kleinerem Maßstab verwendet werden und sind Methoden der Wahl für Experimente, die eine sehr hohe Zellreinheit erfordern, wie z. B. Gen- und Proteinexpressionsstudien.
Die zweite Art der Isolationsmethode ist gradienten- und dichtebasiert. Es beinhaltet normalerweise Percoll, Ficoll-Paque oder andere Polysaccharid / Polyvinylpyrrolidon-Komponenten und nutzt die Zentrifugationskraft, um verschiedene Arten von Blutzellen basierend auf der Zelldichte zu trennen. Diese Methoden werden oft durch die Sedimentation der roten Blutkörperchen durch Dextran ergänzt. Diese Methoden können größere Skalen von Ausgangsmaterial verarbeiten und können auch eine hohe Reinheit erreichen. Ein Vorbehalt der dichtebasierten Isolierung ist die ineffiziente Trennung anderer weit weniger häufiger Granulozyten (meist Eosinophile) von Neutrophilen, und es ist daher die Haupteinschränkung des vorgestellten Protokolls, da selbst das Vorhandensein einer kleinzelligen Kontamination die Reaktion der Neutrophilen beeinflussen kann24.
Hier wird eine zusammengefasste Methode vorgestellt, die auf Gradientenisolation basiert und frühere Methoden10,22 verfeinert. Wir nutzen die derzeitige Unterbewertung der Neutrophilenspezifitäten, um rein menschliche Neutrophile mit begrenzten Restplättchen und Erythrozyten zuverlässig zu isolieren und so die Aktivierung von Neutrophilen und einen beschleunigten Tod zu verhindern. Der wichtigste Schritt ist die Schichtung des Gradienten, die viel effektiver erreicht wird, indem das Dichtegradientenmedium unter dem Blut hinzugefügt wird, um eine scharfe Grenzfläche zu erhalten. Eine schnelle Untersuchung des PBMC-Rings und des Gradienten nach der Zentrifugation kann mögliche Kontaminationen, Aktivierungen und geringe Ausbeuten aufdecken. Bei der Arbeit mit einer Leukapheresemembran oder einem Buffy-Mantel ist die Verdünnung des Blutes wichtig, da eine übermäßige Zelldichte zu Zellaggregation führen würde, was zu Verunreinigungen und Zellaktivierung führen würde.
Dieses Protokoll sollte innerhalb von 2 h abgeschlossen werden, um die Zellfrische zu gewährleisten, und Schritte mit dem Dichtegradientenmedium, Dextran und der Lyse sollten sofort durchgeführt werden, da die Exposition gegenüber diesen Lösungen Neutrophile verändern kann. Mit diesem Protokoll beträgt die erwartete Ausbeute an Neutrophilen mindestens ~ 10 Millionen / 10 ml Vollblut und mindestens ~ 60 Millionen / 10 ml Buffy Coat. Die Bewertung der Isolationsqualität sollte wie folgt erfolgen: aktivierte Neutrophile sollten weniger als 10%, Lymphozytenkontamination weniger als 5%, minimal eosinophil (gleiche Seitenstreuung, aber niedrigere Vorwärtsstreupopulation) und Zelllebensfähigkeit sollte über 90% liegen. Eine geringere Reinheit kann durch unsachgemäße Schichtung oder Lagerung des Dichtegradientenmediums oder durch die Qualität und Frische des Ausgangsblutprodukts entstehen.
The authors have nothing to disclose.
Dieses Projekt wurde von P01HL095489 unterstützt. A.Y.H wurde von T32HL066987 unterstützt.
3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell technologies | #07060 | |
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