विधि का लक्ष्य माउस मॉडल में हाइपरथर्मिया या गर्मी-प्रेरित दौरे के लिए स्क्रीन करना है। प्रोटोकॉल शरीर के तापमान की निरंतर निगरानी के साथ एक कस्टम-निर्मित कक्ष के उपयोग का वर्णन करता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या ऊंचा शरीर का तापमान दौरे की ओर जाता है।
ट्रांसजेनिक माउस मॉडल मिर्गी सहित मानव न्यूरोलॉजिकल विकारों के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने में शक्तिशाली उपकरण साबित हुए हैं। SCN1A-संबद्ध आनुवंशिक मिर्गी में अपूर्ण पेनेट्रेंस और नैदानिक परिवर्तनशीलता के साथ जब्ती विकारों का एक विस्तृत स्पेक्ट्रम शामिल है। SCN1A उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप जब्ती फेनोटाइप की एक बड़ी विविधता हो सकती है, जिसमें सरल, आत्म-सीमित बुखार से जुड़े ज्वर के दौरे (एफएस), ज्वर के दौरे के साथ मध्यम स्तर की आनुवंशिक मिर्गी प्लस (जीईएफएस +) से लेकर अधिक गंभीर ड्रेवेट सिंड्रोम (डीएस) तक शामिल हैं। हालांकि एफएस आमतौर पर 6-7 वर्ष से कम उम्र के बच्चों में देखा जाता है, जिनके पास आनुवंशिक मिर्गी नहीं होती है, जीईएफएस + रोगियों में एफएस वयस्कता में जारी रहता है। परंपरागत रूप से, प्रयोगात्मक एफएस को चूहों में जानवर को सूखी हवा या हीटिंग लैंप की एक धारा में उजागर करके प्रेरित किया गया है, और शरीर के तापमान में परिवर्तन की दर अक्सर अच्छी तरह से नियंत्रित नहीं होती है। यहां, हम एक कस्टम-निर्मित हीटिंग चैंबर का वर्णन करते हैं, जिसमें एक plexiglass फ्रंट होता है, जो एक डिजिटल तापमान नियंत्रक और एक हीटर-सुसज्जित इलेक्ट्रिक फैन के साथ फिट होता है, जो तापमान-नियंत्रित तरीके से परीक्षण क्षेत्र में गर्म मजबूर हवा भेज सकता है। कक्ष में रखे गए माउस के शरीर के तापमान, एक रेक्टल जांच के माध्यम से निगरानी की जाती है, को कक्ष के अंदर तापमान बढ़ाकर पुन: प्रस्तुत करने योग्य तरीके से 40-42 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाया जा सकता है। हीटिंग अवधि के दौरान जानवरों की निरंतर दृश्य निगरानी शरीर के तापमान पर एक एफएस उत्परिवर्तन ले जाने वाले चूहों में गर्मी-प्रेरित बरामदगी के प्रेरण को दर्शाती है जो जंगली-प्रकार के कूड़े के साथी में व्यवहारिक दौरे को प्राप्त नहीं करती है। जानवरों को आसानी से कक्ष से हटाया जा सकता है और शरीर के तापमान को सामान्य करने के लिए तेजी से वापस करने के लिए एक शीतलन पैड पर रखा जा सकता है। यह विधि मिर्गी माउस मॉडल में गर्मी-प्रेरित दौरे की घटना के लिए एक सरल, तेजी से, और पुन: प्रस्तुत करने योग्य स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल प्रदान करती है।
मिर्गी, संयुक्त राज्य अमेरिका में न्यूरोलॉजिकल विकारों का चौथा सबसे आम परिवार 1, सीएनएस में उत्तेजक और निरोधात्मक ड्राइव के असंतुलन की विशेषता है जो आवर्तक दौरे की ओर जाता है। ज्वर के दौरे (एफएस) या बुखार से जुड़े दौरे सामान्य आबादी में हो सकते हैं, अक्सर 6-7 वर्ष की आयु के माध्यम से 3 महीने की शुरुआत में बच्चों में। हालांकि, आनुवांशिक उत्परिवर्तन वाले कुछ व्यक्तियों में, अक्सर सोडियम चैनल जीन में, एफएस वयस्कता में 7 साल की उम्र से परे जारी रह सकता है। इस स्थिति को ज्वर के दौरे के साथ-साथ या एफएस + के रूप में जाना जाता है। जीनोम अनुक्रमण में तेजी से प्रगति ने मानव सोडियम आयन चैनल जीन एससीएन 1 ए में 1,300 से अधिक उत्परिवर्तनों की पहचान की है, जो इसे मिर्गी उत्परिवर्तन के लिए एक हॉटस्पॉट बनाता है। SCN1A उत्परिवर्तन को जब्ती विकारों के एक विस्तृत स्पेक्ट्रम से जोड़ा गया है, जिसमें ज्वर के दौरे (एफएस), ज्वर के दौरे के साथ आनुवंशिक मिर्गी प्लस (जीईएफएस +), और ड्रेवेट सिंड्रोम (डीएस) 2,3,4,5,6 शामिल हैं। SCN1A मिससेंस म्यूटेशन का लगभग 20% GEFS + 5,7,8 की ओर जाता है। बचपन में जटिल या लंबे समय तक एफएस का बाल चिकित्सा इतिहास बाद में मिर्गी के अधिक दुर्बल रूपों में विकसित हो सकता है जैसे कि टेम्पोरल लोब मिर्गी (टीएलई) 9,10,11। Dravet सिंड्रोम ट्रंकेशन उत्परिवर्तन या SCN1A में समारोह उत्परिवर्तन के नुकसान के कारण उत्पन्न होता है और असभ्य मिर्गी का एक गंभीर रूप है, ज्वर के दौरे की बचपन की शुरुआत के साथ जो दुर्दम्य दौरे में विकसित होते हैं, और अक्सर संज्ञानात्मक, विकासात्मक और मोटर हानि 2,5,12 के साथ जुड़ा होता है . चूंकि जीईएफएस + और / या डीएस वाले कई व्यक्ति ज्वर के दौरे का प्रदर्शन करते हैं, इसलिए इन जब्ती विकारों का बेहतर मुकाबला करने के लिए उपन्यास उपचार विकसित करना अनिवार्य हो जाता है।
एससीएन 1 ए से जुड़े मिर्गी के पशु मॉडल ने विभिन्न प्रकार के दौरे (ज्वर बनाम सामान्यीकृत) की विशेषता और जब्ती पीढ़ी के न्यूरोनल तंत्र को विच्छेदन करने में अमूल्य साबित किया है13,14,15,16,17,18। जबकि कृंतक दिमाग में ईईजी / ईएमजी रिकॉर्डिंग के माध्यम से सहज दौरे का अध्ययन अच्छी तरह से स्थापित है और एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है, केवल कुछ अध्ययनों ने माउस मॉडल में ज्वर के दौरे की नकल करने का प्रयास किया है14,16,19,20,21,22,23 . पिछले अध्ययनों ने गर्म सूखी हवा के जेट का उपयोग किया है, या एक थर्मल सिस्टम के साथ फिट एक मेथाक्रिलेट सिलेंडर, या संलग्न परीक्षण एरेनास 9,16,21,22,23,24 में तापमान नियंत्रक के साथ हीट लैंप हाइपरथर्मिया के माध्यम से दौरे को प्रेरित करने के लिए। अधिक नियंत्रित वातावरण में शरीर के तापमान को बढ़ाने के लिए, यहां वर्णित प्रोटोकॉल तापमान-नियंत्रित हीटिंग सिस्टम के साथ एक कस्टम-निर्मित कक्ष का उपयोग करता है जो कक्ष के अंदर माउस के शरीर के तापमान में वृद्धि की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दरों की अनुमति देता है। गर्मी कक्ष लकड़ी से बनाया गया था (लंबाई 40 सेमी x चौड़ाई 34 सेमी x ऊंचाई 31 सेमी) और एक के थर्मोकपल के साथ एक डिजिटल तापमान नियंत्रक के साथ फिट किया गया था। कक्ष के बैक पैनल पर एक हीटर से सुसज्जित एक छोटा अक्षीय प्रशंसक एक डिजिटल तापमान नियंत्रक द्वारा विनियमित कक्ष में गर्म हवा को निर्देशित करता है। यह मजबूर हवा हीटिंग सिस्टम एक दर को नियंत्रित करने में सक्षम बनाता है जिस पर कक्ष का तापमान बढ़ जाता है। (चित्र 1A, B)। लकड़ी की गर्मी कक्ष के अंदर स्थित कश्मीर थर्मोकपल डिजिटल तापमान नियंत्रक को प्रतिक्रिया भेजता है, परख के दौरान बॉक्स के अंदर निरंतर तापमान बनाए रखने के लिए। डिजिटल तापमान नियंत्रक पर तापमान सेट करना, बिजली के पंखे को कक्ष को समान रूप से गर्म करने के लिए वेंट्स के माध्यम से गर्म मजबूर हवा भेजने में सक्षम बनाता है (चित्रा 1 ए)। हीट चैंबर के सामने पैनल परीक्षणों की आसान वीडियो रिकॉर्डिंग को सक्षम करने के लिए एक स्पष्ट plexiglass शीट है।
वयस्क (P30-P40) चूहों, SCN1A में एक missense उत्परिवर्तन के लिए विषमयुग्मजी है कि GEFS + और जंगली प्रकार के कूड़े के साथी की एक समान संख्या नियंत्रण समूह के रूप में सेवा करने के लिए कारण बनता है, प्रत्येक प्रयोग के लिए चुना गया था। इन अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले नर और मादा दोनों का वजन कम से कम 15 ग्राम था क्योंकि कम वजन वाले जंगली-प्रकार के चूहे एक ही उम्र के भारी जानवरों की तुलना में गर्मी से प्रेरित दौरे के प्रति अधिक संवेदनशील थे। पायलट अध्ययन में, उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के चूहों दोनों को पीछे की ओर कक्ष के कूलर कोनों की तलाश करने के लिए देखा गया था और लंबे समय तक वहां रहे। इसे दरकिनार करने के लिए, गर्मी कक्ष परीक्षण क्षेत्र के अंदर प्रभावी फर्श का आकार 16.5 सेमी x चौड़ाई 21.5 सेमी x ऊंचाई 27.5 सेमी लंबाई तक कम हो गया था, जो कक्ष के दाईं ओर लकड़ी के ब्लॉक बी (आयाम 20 सेमी x 8 सेमी x 7.2 सेमी) रखकर कम हो गया था (चित्रा 1 ए)। गर्मी कक्ष का निर्माण 1.9 सेमी मोटी प्लाईवुड (लंबाई 40 सेमी x चौड़ाई 34 सेमी x ऊंचाई 31 सेमी) से किया गया था, जो सफेद टुकड़े टुकड़े के साथ कवर किया गया था और एक के थर्मोकपल के साथ एक डिजिटल तापमान नियंत्रक के साथ फिट किया गया था। कक्ष की दीवारों की टुकड़े टुकड़े की सतह अपारगम्य है और 70% इथेनॉल के साथ पोंछकर परीक्षणों के बीच आसानी से साफ किया जा सकता है। गर्मी कक्ष का तापमान शुरू में 50 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया गया था और प्रयोग की शुरुआत से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए प्रीहीट किया गया था, ताकि चैंबर के अंदर समान हीटिंग सुनिश्चित की जा सके। प्रत्येक माउस को प्रयोग के दौरान शरीर के तापमान की निरंतर निगरानी के लिए एक रेक्टल थर्मामीटर के साथ फिट किया गया था। एक बार में कक्ष में एक एकल माउस रखा गया था और तापमान को पहले-10 वें मिनट के बीच 50 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था। तापमान को तब 11 वें-20 वें मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ा दिया गया था, और अंत में 21 वें-30 वें मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ा दिया गया था। इसके परिणामस्वरूप माउस शरीर के तापमान (चित्रा 2 ए) में वृद्धि की एक पुनरुत्पादक दर हुई। प्रत्येक परीक्षण को वीडियो-टेप किया गया था और व्यवहार विश्लेषण ऑफ़लाइन आयोजित किया गया था।
हीटिंग प्रोटोकॉल को गर्मी कक्ष के प्रारंभिक तापमान को बदलने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है और उस दर को बदलने के लिए जो कक्ष को गर्म किया जाता है, जो बदले में बदलता है कि परख के दौरान माउस के शरीर का तापमान कितनी जल्दी ऊंचा होता है। इस प्रकार, यह विधि गर्मी-प्रेरित दौरे से जुड़े व्यवहार स्क्रीन की स्थापना में पारंपरिक तरीकों पर अधिक लचीलापन प्रदान करती है। गर्मी-प्रेरित जब्ती प्रोटोकॉल का उपयोग एंटी-मिर्गी की दवाओं के लिए स्क्रीन करने के लिए भी किया जा सकता है जो उत्परिवर्ती चूहों को गर्मी-प्रेरित दौरे के लिए अधिक प्रतिरोधी बनाते हैं या दहलीज तापमान को बढ़ाते हैं जिस पर दौरे देखे जाते हैं। इसी तरह, गर्मी से प्रेरित दौरे पर कीटो आहार जैसे प्रतिबंधात्मक आहार शासनों के लाभकारी प्रभावों की जांच सामान्य चाउ-फेड बनाम कीटो-खिलाए गए चूहों में की जा सकती है।
चित्र1: कस्टम-निर्मित माउस हीट चैंबर का विवरण। (A) लकड़ी के माउस हीट चैंबर का फ्रंट पैनल पावर ऑन / ऑफ स्विच वाले साइड कंट्रोल पैनल को दिखाता है जो डिजिटल तापमान नियंत्रक, के थर्मोकपल, फैन हीटर के चालू / बंद स्विच और गर्मी संकेतक को चालू करता है। बॉक्स के बाहरी आयाम और आंतरिक परीक्षण क्षेत्र को सेमी में दिखाया गया है। परीक्षण क्षेत्र की सतह को प्रभावी ढंग से कम करने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक लकड़ी का ब्लॉक बी भी दिखाया गया है। परीक्षण क्षेत्र के निचले हिस्से को कोब बिस्तर के साथ कवर किया गया है ताकि चूहों को सीधे गर्म लकड़ी की सतहों के संपर्क में आने से रोका जा सके। (बी) गर्मी कक्ष का बैक पैनल शीर्ष हवा के वेंट पर घुड़सवार पंखे और कक्ष को बिजली की आपूर्ति करने के लिए पावर कॉर्ड को दिखाता है। इस आंकड़े को दास एट अल. 2021, eNeuro14 में चित्रा 3 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
हम चूहों में गर्मी से प्रेरित दौरे की घटना के लिए स्क्रीन करने के लिए एक सरल और प्रभावी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो मानव रोगियों में ज्वर के दौरे के व्यवहार के बराबर है। परख कई मापदंडों का मूल्यांकन करता है – जिसमें दौरे, जब्ती सीमा, एक रैसिन पैमाने पर दौरे की गंभीरता दिखाने वाले चूहों के प्रतिशत सहित, शरीर के तापमान में वृद्धि के लिए नियंत्रण और परीक्षण चूहों के समूहों की संवेदनशीलता की तुलना करने के लिए।
इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम में माउस के शरीर के तापमान की लगातार निगरानी करते हुए कक्ष में गर्मी को बढ़ाना शामिल है। यह आवश्यक है कि इन assays में चूहों का अनुभव होने वाला अधिकतम शरीर का तापमान 44 डिग्री सेल्सियस है क्योंकि जंगली प्रकार के जानवर शरीर के तापमान >44 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी से प्रेरित दौरे से गुजर सकते हैं। सामान्य संज्ञाहरण या एनाल्जेसिक के साथ pretreatment जानवरों के मुख्य शरीर के तापमान को कम कर सकता है या थर्मोरेगुलेशन के साथ हस्तक्षेप कर सकता है, जो बदले में जब्ती दहलीज तापमान डेटा संग्रह को भ्रमित करेगा। इस प्रकार, इस स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के तहत चूहों को 30 मिनट की परीक्षण विंडो के दौरान इन एजेंटों के साथ प्रदान नहीं किया जा सका। सभी प्रक्रियाओं को संस्थान की IACUC समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए। परख के दौरान माउस के कोर शरीर के तापमान की निरंतर निगरानी सुनिश्चित करने के लिए, सुरक्षित रूप से चूहों की पूंछ के लिए मलाशय तापमान जांच टेप। यदि परख के दौरान, माउस शरीर का तापमान माउस कक्ष के तापमान को बढ़ाने के बाद भी लंबे समय तक अपरिवर्तित रहने के लिए पाया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि रेक्टल तापमान जांच माउस से बाहर नहीं आई है या पूंछ से शिथिल रूप से जुड़ी हुई है।
माउस मॉडल की आनुवंशिक पृष्ठभूमि SCN1A उत्परिवर्तन और औषधीय रूप से प्रेरित बरामदगी 18,25,26,27 के प्रति संवेदनशीलता को प्रभावित कर सकती है। जैसा कि ऊपर दिए गए परिणामों में चर्चा की गई है, चूहों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि गर्मी से प्रेरित दौरे के लिए उनकी संवेदनशीलता को प्रभावित कर सकती है। Scn1a K1270T GEFS + उत्परिवर्ती चूहों को दो आनुवंशिक पृष्ठभूमि में परीक्षण किया गया था – 129X1 और B6NJ, और जब्ती संवेदनशील B6NJ पृष्ठभूमि में जंगली प्रकार के चूहों (33%) का एक छोटा प्रतिशत, गर्मी-प्रेरित दौरे से गुजरने के लिए भी देखा गया था। हालांकि, विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती Scn1aKT / + चूहों की तुलना में, B6NJ जंगली प्रकार के चूहों ने काफी अधिक तापमान सीमा पर गर्मी-प्रेरित दौरे का अनुभव किया। यह पुष्टि करता है कि आनुवंशिक उत्परिवर्तन (Scn1a K1270T) जिसे CRISPR नॉक-इन द्वारा पेश किया गया था, उत्परिवर्ती चूहों को हाइपरथर्मिया-प्रेरित दौरे के लिए अतिसंवेदनशील बनाता है।
इस प्रोटोकॉल को अपनाने के कई फायदे हैं, जिन्हें नीचे संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। सबसे पहले, सूखी हवा या गर्म लैंप की धारा के उपयोग के विपरीत, एक संलग्न स्थान के भीतर स्थापित एक तापमान-नियंत्रित मजबूर हवा प्रयोगकर्ता को वांछित दर पर परीक्षण क्षेत्र को गर्म करने पर अधिक नियंत्रण प्रदान करती है। हीटिंग प्रोटोकॉल में चरणों को आसानी से शुरुआती तापमान, प्रत्येक चरण की अवधि, आदि को बढ़ाने / कम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है ताकि पुराने चूहों को स्क्रीन किया जा सके जो चूहों जैसे भारी या बड़े कृन्तक हैं। दूसरा, संलग्न रेक्टल जांच के माध्यम से माउस शरीर के तापमान की निरंतर निगरानी, परख के दौरान व्यक्तिगत माउस में शरीर के तापमान में परिवर्तन की दर के बारे में मूल्यवान जानकारी देता है। यह प्रयोगकर्ता को बारीकी से यह देखने की अनुमति देता है कि माउस में तापमान परिवर्तन की दर 0.25-0.5 डिग्री सेल्सियस / मिनट (जो जानवरों के लिए तनावपूर्ण हो सकती है) से अधिक नहीं है, जब इस प्रोटोकॉल को अन्य परीक्षण एरेनास के अनुकूल बनाया जाता है। महत्वपूर्ण रूप से, विभिन्न चूहों के समूहों में समय के साथ शरीर के तापमान में परिवर्तन की दर थर्मोरेग्युलेट करने की उनकी क्षमता पर प्रकाश डाल सकती है और यह समझने में सहायक हो सकती है कि क्या ज्वर की जब्ती उत्परिवर्तन के कारण चूहों में थर्मोरेगुलेशन भी बदल जाती है। तीसरा, निरंतर शरीर के तापमान की निगरानी यह सुनिश्चित करती है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके जब्ती थ्रेशोल्ड तापमान माप सटीक हैं, क्योंकि वे माउस द्वारा अनुभव किए गए जब्ती के पहले मुकाबले के साथ समवर्ती रूप से दर्ज किए जाते हैं। यदि जानवर के शरीर के तापमान की लगातार निगरानी नहीं की जाती है या जानवर को परीक्षण क्षेत्र से बाहर निकालने के बाद जब्ती थ्रेशोल्ड तापमान मापा जाता है, तो जब्ती थ्रेशोल्ड मान दौरे के बाद चूहों को संभालने में लगने वाले समय के कारण भिन्न हो सकते हैं। अंत में, यह विधि मानव रोगियों में ज्वर के दौरे की नकल करने के लिए चूहों में बुखार (रोगजनकों को इंजेक्ट करके) को प्रेरित करने के लिए आक्रामक तरीकों का उपयोग करने की आवश्यकता को दरकिनार करती है।
इस प्रोटोकॉल की सीमाओं में से एक यह है कि गर्मी से प्रेरित दौरे के लिए किशोर (उम्र में पी 30 से कम) चूहों को स्क्रीन करना मुश्किल है। प्रोटोकॉल को वयस्क चूहों (P30-P40 और उससे ऊपर) की संवेदनशीलता के लिए स्क्रीन करने के लिए विकसित किया गया था, गर्मी- या हाइपरथर्मिया-प्रेरित दौरे के लिए। हमारे अनुभव में, छोटे जंगली-प्रकार के चूहों, विशेष रूप से 15 ग्राम से कम वजन वाले, गर्मी से प्रेरित दौरे से गुजरने की अधिक संभावना रखते हैं, जो अविकसित थर्मोरेगुलेशन तंत्र, शारीरिक थर्मल तनाव, या दोनों के संयोजन के कारण हो सकता है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके किशोर चूहों पर गर्मी-प्रेरित जब्ती स्क्रीन करना आदर्श नहीं है।
भविष्य के अध्ययन जो माउस को गर्मी से प्रेरित दौरे के अधीन करते हुए ईईजी निगरानी को जोड़ते हैं, वे पिछले अध्ययन 19 के समान गर्मी-प्रेरित दौरे के ईईजी जब्ती पैटर्न पर प्रकाश डाल सकते हैं। माउस मस्तिष्क में विशिष्ट क्षेत्रों में न्यूरोनल गतिविधि को मस्तिष्क के ऊतकों की कटाई के बाद ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोण और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री-आधारित अध्ययनों के संयोजन से पता लगाया जा सकता है। इसके अलावा, ज्वर के दौरे को कम करने पर कीटो आहार जैसे प्रतिबंधात्मक आहार के प्रभावों का मूल्यांकन कीटो-फेड चूहों और सामान्य चाउ-फेड चूहों को गर्मी-प्रेरित जब्ती प्रोटोकॉल के अधीन करके किया जा सकता है। इसी तरह, मिर्गी दवा स्क्रीनिंग प्रतिमानों को उम्मीदवार विरोधी मिर्गी की दवाओं का परीक्षण करने और पहचानने के लिए विकसित किया जा सकता है जो वाहन-खिलाया या नियंत्रण चूहों की तुलना में दवा-खिलाया या इलाज किए गए चूहों में गर्मी-प्रेरित दौरे को सुधारते हैं या दबाते हैं।
The authors have nothing to disclose.
हम अनुकूलित माउस गर्मी कक्ष के निर्माण में उनकी मदद के लिए कॉनर जे स्मिथ को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम परख विकास के शुरुआती चरणों के दौरान हीटिंग प्रोटोकॉल को मानकीकृत करने के लिए O’Dowd प्रयोगशाला के सदस्यों, लिशा ज़ेंग और एंड्रयू साल्गाडो की मदद को स्वीकार करते हैं। हम पांडुलिपि के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया के कुछ हिस्सों की वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए डैनी बेनाविड्स और कुमार पेरिनबाम को भी धन्यवाद देते हैं। इस कार्य को NIH अनुदान (NS083009) द्वारा समर्थित किया गया था, जो D.O.D. को सम्मानित किया गया था।
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