Burada, poli (beta aminoester) polimerlere dayalı mRNA nanopartikülleri üretmek için basit bir protokol sunulmaktadır, kapsüllenmiş mRNA değiştirilerek uyarlanabilir. Polimerleri, nanopartikülleri ve in vitro temel karakterizasyonlarını sentezlemek için iş akışı da açıklanmıştır. Bağışıklama ile ilgili bir kavram kanıtı da ekleniyor.
Aşılama modern toplumun en büyük başarılarından biri olmuştur ve hastalığın kontrol altına alma ve önlemede vazgeçilmezdir. Geleneksel aşılar enfeksiyöz ajanın tamamından veya kesirlerinden oluşuyordu. Bununla birlikte, zorluklar devam ediyor ve yeni aşı teknolojileri zorunlu. Bu bağlamda, sars-CoV-2 enfeksiyonunu önleyen iki mRNA aşısının hızlı bir şekilde onaylanmasıyla gösterildiği gibi, mRNA’nın bağışıklama amacıyla kullanılması gelişmiş bir performans göstermiştir. Viral enfeksiyonları önlemede başarının ötesinde, mRNA aşıları terapötik kanser uygulamaları için de kullanılabilir.
Bununla birlikte, mRNA’nın kararsızlığı ve çekirdeklerin varlığı nedeniyle vücuttan hızlı bir şekilde temizlenmesi çıplak teslimatını mümkün kılmaz hale getirir. Bu bağlamda, nanotıplar ve özellikle polimerik nanopartiküller kritik mRNA dağıtım sistemleridir. Bu nedenle, bu makalenin amacı, tescilli polimerik nanopartiküllere dayanarak bir mRNA aşı adayının formülasyonu ve testi için protokolü açıklamaktır. Kullanılan polimerlerin sentezi ve kimyasal karakterizasyonu, nanopartiküller oluşturmak için mRNA ile kompleksleşmesi ve lizofilizasyon metodolojileri burada tartışılacaktır. Bu, depolama ve dağıtım maliyetlerini azaltmak için çok önemli bir adımdır. Son olarak, in vitro transfect ve olgun model dendritik hücrelere kapasitelerini göstermek için gerekli testler belirtilecektir. Bu protokol, bu aşıların çok çeşitli hastalıkları önlemesini veya iyileştirmesini sağlayan yüksek çok yönlülüğü nedeniyle aşılama üzerinde çalışan bilim camiasına fayda sağlayacaktır.
Bulaşıcı hastalıklar dünya çapında milyonlarca insan için ciddi bir tehdit oluşturmuş ve hala bazı gelişmekte olan ülkelerde önde gelen ölüm nedenlerinden biridir. Profilaktik aşılama, modern toplumun bulaşıcı hastalıkları önlemek ve kontrol etmek için en etkili müdahalelerinden biri olmuştur1,2. 20. yüzyıl ilgisindebilimin bu kritik kilometre taşları SARS-CoV-2 virüsünün neden olduğu son dünya çapındaki Covid-19 salgını tarafından dile getirildi3. Hastalığın yayılmasını engellemek için verimli aşılara sahip olmanın öneminin farkına vararak, tüm biyomedikal topluluklardan gelen işbirliği çabaları, bir yıldan kısa bir sürede piyasada birçok profilaktik aşı ile başarılı bir şekilde sonuçlanmıştır4.
Geleneksel olarak, aşılar zayıflatma (canlı, azaltılmış virülans) veya inaktive (ölüm parçacıkları) virüslerinden oluşuyordu. Bununla birlikte, güvenlik hataları için marjı olmayan bazı hastalıklar için viral parçacıklar mümkün değildir ve bunun yerine protein alt birimleri kullanılır. Bununla birlikte, alt ünvanlar genellikle birden fazla epitop / antijen kombinasyonunu etkinleştirmez ve aşılama gücünü artırmak için yardımcılar gerekir5,6. Bu nedenle, yeni aşı türlerine olan ihtiyaç açıktır.
Mevcut pandemi sırasında da gösterildiği gibi, nükleik asitlere dayalı yeni aşı adayları, uzun gelişim süreçlerinden kaçınmak ve aynı zamanda hayati bir hasta bağışıklama üretirken yüksek çok yönlülük sağlamak açısından avantajlı olabilir. Bu, başlangıçta deneysel kanser aşısı olarak tasarlanan mRNA aşıları için de böyledir. Antijene özgü T hücre yanıtları üretme doğal kapasiteleri sayesinde3,5,6,7. MRNA antijenik proteini kodlayan molekül olarak, sadece aynı şekilde değişen aşı, aynı mikroorganizmanın diğer varyantlarını, farklı suşları, diğer enfeksiyöz mikroorganizmaları bağışıklık kazanmak ve hatta bir kanser immünoterapik tedavisi haline gelmek için hızla uyarlanabilir. Ayrıca büyük ölçekli üretim maliyetleri açısından avantajlıdırlar. Bununla birlikte, mRNA çıplak yönetimlerini engelleyen önemli bir engele sahiptir: çekirdeğin dolu fizyolojik medyada istikrarı ve bütünlüğü tehlikeye girer. Bu nedenle, onu koruyan ve mRNA’yı antijen sunan hücrelere vektörleştiren bir nanometrik taşıyıcının kullanılmasıgerekir 2,8.
Bu bağlamda, poli (beta aminoesterler) (pBAE), katyonik yükleri9,10,11sayesinde nanometrik parçacıklarda karmaşık mRNA’ya olağanüstü bir yetenek gösteren biyouyumlu ve biyobozunur polimerler sınıfıdır. Bu polimerler, fizyolojik koşullarda esterazlar tarafından bozulmalarını kolaylaştıran ester bağlarından oluşur. pBAE kütüphane adayları arasında, son katyonik oligopeptidlerle işlevsel hale getirilenler, endositoz yoluyla hücrelere verimli bir şekilde nüfuz etmek ve kapsüllenmiş gen materyalini transfect etmek için küçük nanopartiküller oluşturmak için daha yüksek bir kapasite gösterdi. Ayrıca, tamponlama kapasiteleri sayesinde, endozom bölmesinin asitlenmesi endosomal kaçış sağlar12,13. Yani, belirli bir tür pBAE, stabilitelerini ve uç-oligopeptid kombinasyonlarını geliştirmek için omurgalarındaki hidrofobik moieties (C6 pBAE olarak adlandırılır) dahil olmak üzere (polimerin% 60’ı üç lizin ve 40 ile modifiye edilmiştir Parenteral uygulamadan sonra antijen sunan hücreleri seçici olarak transfects ve fare bağışıklama tarafından izlenen mRNA kodlu antijen sunumunu üreten tri-histidinli polimerin% yakın zamanda yayınlanmıştır14 . Ek olarak, bu formülasyonların nanotıp formülasyonlarının ana darboğaz adımlarından birini atlatabileceği de gösterilmiştir: yumuşak kuru ortamlarda uzun süreli stabilite sağlayan işlevlerini kaybetmeden dondurma-kurutma imkanı15.
Bu kapsamda mevcut protokolün amacı, protokoldeki kritik adımların açıklamasını yaparak, bulaşıcı hastalıkların önlenmesi ve tümör tedavisi uygulamaları için verimli aşıların üretilmesini sağlayarak mRNA nanopartiküllerinin oluşumuna ilişkin prosedürü bilim camiasının kullanımına açmaktır.
Aşağıdaki protokol, nanopartikül sentezi için daha fazla kullanılacak oligopeptid son modifiye poli (beta aminoesterler) – OM-pBAE polimerlerini sentezlemek için tam egzersizi açıklar. Protokolde nanopartikül formülasyonu da yer almaktadır. Buna ek olarak, prosedürün başarısı için kritik adımlar ve elde edilen formülasyonların olumlu veya olumsuz bir sonuç tanımlamak için gerekli kalite kontrol karakterizasyon özelliklerini gerçekleştirmesini sağlamak için de sağlanır. Bu protokol Şekil 1‘de özetlenmiştir.
Geçen yıl Covid-19 salgınının patlak verinin ardından aşıların bulaşıcı hastalık kontrolü açısından önemi kritik bir bileşen olarak kendini göstermiştir8. Dünya çapındaki bilim adamlarının çabaları, birçok aşının piyasaya sürülmesini sağladı. Tarihte ilk kez, mRNA aşıları, bazı aylar içinde herhangi bir yeni antijene uyum sağlama kapasiteleri nedeniyle hızlı tasarımları sayesinde daha önce hipotezlenmiş başarılarını göstermiştir<sup class="xref…
The authors have nothing to disclose.
MINECO/FEDER’in (SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 ve COV20/01100 hibeleri) finansal desteği kabul edilmektedir. CGF, IQS Doktora Bursunu kabul etti.
1,4-butanediol diacrylate | Sigma Aldrich | 123048 | |
1-hexylamine | Sigma Aldrich | 219703 | |
5-amino-1-pentanol | Sigma Aldrich | 411744 | |
Acetone | Panreac | 141007 | |
CD11b antibody | BD | 550993 | |
CD86 antibody | Bioligend | 105007 | |
Chlor hydroxhyde | Panreac | 181023 | |
Chloroform-d | Sigma Aldrich | 151823 | |
Cys-His-His-His peptide | Ontores | Custom | |
Cys-Lys-Lys-Lys peptide | Ontores | Custom | |
D2O | Sigma Aldrich | 151882 | |
DEPC reagent for Rnase free water | Sigma Aldrich | D5758 | This reagent is important to treat MilliQ water to remove any RNases of the buffers |
Diethyl eter | Panreac | 212770 | |
dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 276855 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
mRNA EGFP | TriLink Technologies | L-7601 | |
mRNA OVA | TriLink Technologies | L-7610 | |
RiboGreen kit | ThermoFisher | R11490 | |
sodium acetate | Sigma Aldrich | 71196 | |
sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031 | |
Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11570626 | |
α-mouse AlexaFluor488 antibody | Abcam | Ab450105 | |
Equipment | |||
Nanoparticle Tracking Analyzer | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | |
Nuclear Magnetic Ressonance Spectrometer | Varian | 400 MHz | |
ZetaSizer | Malvern Panalytical | Nano ZS | For zeta potential and hydrodynamic size determination |
Software | |||
NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | MAN0515-02-EN-00 | |
NovoExpress Software | Agilent | Not specified | |
ZetaSizer software | Malvern Panalytical | DTS Application | To analyze surface charge and hydrodynamic sizes |