इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य यह वर्णन करना है कि स्टैफिलोकोकस ऑरियस आंतरिककरण की सीमा और मानव मेजबान सेल के अंदर जीवित रहने की इसकी क्षमता, साथ ही साथ रोगाणुरोधी यौगिकों की इंट्रासेल्युलर प्रभावकारिता का अध्ययन कैसे किया जाए।
Staphylococcus aureus यूकेरियोट कोशिकाओं में अपने आंतरिककरण को ट्रिगर करने और विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों के अंदर जीवित रहने के लिए वायरस कारकों को व्यक्त करता है। यह पेपर एक एंजाइम संरक्षण परख का वर्णन करता है एस ऑरियस आंतरिककरण की सीमा और अनुयायी गैर-पेशेवर फागोसाइटिक कोशिकाओं (एनपीपीसी) के साथ-साथ रोगाणुरोधी यौगिकों की इंट्रासेल्युलर प्रभावकारिता में इसके इंट्रासेल्युलर अस्तित्व का अध्ययन करने के लिए। एनपीपीसी को एक बहु-अच्छी तरह से प्लेट में उगाया जाता है जब तक कि वे 100% संगम तक नहीं पहुंच जाते। एस ऑरियस संस्कृतियों को सेल संस्कृति माध्यम में रातोंरात उगाया जाता है। संक्रमण की नियंत्रित बहुलता पर कोशिकाओं को टीका लगाने के लिए प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या के अनुसार बैक्टीरियल निलंबन को पतला किया जाता है। संक्रमित कोशिकाओं को एनपीपीसी द्वारा बैक्टीरिया को आंतरिक बनाने की अनुमति देने के लिए 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया जाता है, जिसके बाद लाइसोस्टॉफिन को चुनिंदा रूप से बाह्य कोशिकीय बैक्टीरिया को मारने के लिए संस्कृति माध्यम में जोड़ा जाता है। Lysostaphin प्रयोग के बाकी हिस्सों के लिए संस्कृति माध्यम में मौजूद है।
इस बिंदु पर, संक्रमित कोशिकाओं को एस ऑरियस के खिलाफ उनकी इंट्रासेल्युलर गतिविधियों का आकलन करने के लिए रोगाणुरोधी यौगिकों के साथ ऊष्मायन किया जा सकता है। इसके बाद, दवाओं को हटाने के लिए कोशिकाओं को तीन बार धोया जाता है, और इंट्रासेल्युलर एस ऑरियस लोड को तब अगर प्लेटों पर खेती करके परिमाणित किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, इंट्रासेल्युलर अस्तित्व और सेल विषाक्तता में शामिल स्टैफिलोकोकल वायरस कारकों का अध्ययन करने के लिए, लाइसोस्टैफिन को धोने के चरणों की आवश्यकता को खत्म करने के लिए प्रोटीनेज के के साथ निष्क्रिय किया जा सकता है। यह टिप इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल लोड परिमाणीकरण की विश्वसनीयता में सुधार करती है, खासकर यदि कोशिकाएं संस्कृति प्लेट से अलग हो जाती हैं जब वे इंट्रासेल्युलर एस ऑरियस के गुणन के कारण भारी रूप से संक्रमित हो जाते हैं। इन प्रोटोकॉल का उपयोग लगभग सभी प्रकार के अनुयायी एनपीपीसी के साथ और ऑर्गेनोइड्स जैसे 3 डी सेल कल्चर मॉडल के साथ किया जा सकता है।
Staphylococcus aureus एक जीवन-धमकी रोगज़नक़ और त्वचा और म्यूकोसा का एक कॉमेन्सल बैक्टीरिया दोनों है जो दुनिया भर में दो अरब व्यक्तियों का उपनिवेश करता है। मनुष्यों में, एस ऑरियस के नाक वाहक में गाड़ी के अपने स्वयं के तनाव के साथ संक्रमण का खतरा बढ़ जाता है; हालांकि, एस ऑरियस म्यूकोसल गाड़ी के मल्टीफैक्टोरियल निर्धारक अभी भी अस्पष्ट हैं1,2। तीव्र संक्रमण के अलावा, रोगी क्रोनिक एस ऑरियस संक्रमण भी विकसित कर सकते हैं जो अक्सर इलाज के लिए चुनौतीपूर्ण होते हैं3। उपनिवेशीकरण और संक्रमण के दौरान मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन की बेहतर समझ उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने और रोगी प्रबंधन में सुधार के लिए महत्वपूर्ण है।
इन विट्रो में, एस ऑरियस मेजबान कोशिकाओं में अपने आंतरिककरण को ट्रिगर कर सकता है जो α5π1 integrin4 को व्यक्त करता है। एस ऑरियस, फाइब्रोनेक्टिन की कोशिका दीवार पर लंगर डाले गए स्टैफिलोकोकल फाइब्रोनेक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन के बीच त्रिपक्षीय बातचीत, और मेजबान सेल की सतह पर व्यक्त π1 इंटेग्रिन को एनपीपीसी में एस ऑरियस आंतरिककरण के मुख्य मार्ग के रूप में अच्छी तरह से जाना जाता है जैसे कि केराटिनोसाइट्स, ओस्टियोब्लास्ट्स, फाइब्रोब्लास्ट्स, और उपकला और एंडोथेलियल कोशिकाएं 4। हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि एस ऑरियस नाक उपनिवेशीकरण 5,6 और संक्रमण के दौरान मानव कोशिकाओं के अंदर पाया जा सकता है7। हालांकि, एस ऑरियस संक्रमण के रोगजनन में इंट्रासेल्युलर जलाशय की भूमिका अस्पष्ट बनी हुई है। मेजबान कोशिकाएं एस ऑरियस के लिए एक आश्रय के रूप में कार्य कर सकती हैं, जो प्रतिरक्षा प्रणाली 8 और अधिकांश रोगाणुरोधी यौगिकों 6,9 दोनों से सुरक्षित है।
lysostaphin संरक्षण परख, 1980 के दशक में पहले Proctor10 द्वारा वर्णित, एस aureus आइसोलेट्स के internalization में शामिल जीवाणु और मेजबान कारकों के अध्ययन में सक्षम बनाता है. लाइसोस्टाफिन एक बैक्टीरियोसिन है जो स्टैफिलोकोकस सिमुलन द्वारा उत्पादित है, जो एंटीबायोटिक-प्रतिरोधी उपभेदों सहित लगभग सभी एस ऑरियस आइसोलेट्स के खिलाफ शक्तिशाली गतिविधि प्रदर्शित करता है। Lysostaphin का उपयोग केवल व्यवहार्य इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया की गिनती को सक्षम करने के लिए केवल एक्स्ट्रासेल्युलर एस ऑरियस को नष्ट करने के लिए किया गया है12। इस तकनीक का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है और एस ऑरियस के कई विषाणु कारकों की खोज में योगदान दिया है। Gentamycin, अकेले और lysostaphin के साथ संयुक्त, भी व्यापक रूप से इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है।
हालांकि, हाल के एक अध्ययन से पता चला है कि जेंटामाइसिन यूकेरियोटिक कोशिकाओं में प्रवेश करता है और एक समय और एकाग्रता-निर्भर तरीके से आंतरिक बैक्टीरिया तक पहुंचता है। इस अध्ययन ने यह भी प्रदर्शित किया कि लाइसोस्टाफिन यूकेरियोटिक कोशिकाओं में प्रवेश नहीं करता है, यह पुष्टि करता है कि एक लाइसोस्टाफिन-आधारित एंजाइम सुरक्षा परख (ईपीए) संस्कृति 13 द्वारा इंट्रासेल्युलर एस ऑरियस लोड को मापने के लिए सबसे सटीक परख है। भले ही किस यौगिक का उपयोग बाह्य कोशिकीय बैक्टीरिया (जैसे, लाइसोस्टाफिन या जेंटामाइसिन) को नष्ट करने के लिए किया जाता है, इसे आगर प्लेटों पर इंट्रासेल्युलर एस ऑरियस चढ़ाने से पहले कोशिकाओं को धोकर हटा दिया जाना चाहिए। क्रमिक धोने के परिणामस्वरूप कोशिकाओं की टुकड़ी हो सकती है, विशेष रूप से खराब अनुयायी कोशिकाएं (उदाहरण के लिए, भारी संक्रमित कोशिकाएं), जिससे इंट्रासेल्युलर एस ऑरियस लोड को कम करके आंका जाएगा। यह पेपर विस्तार से वर्णन करता है कि ईपीए का उपयोग इंट्रासेल्युलर एस ऑरियस लोड को मापने और इन विट्रो मॉडल का उपयोग करके रोगाणुरोधी यौगिकों की इंट्रासेल्युलर प्रभावकारिता को मापने के लिए कैसे किया जा सकता है। ध्यान दें, गहन धोने से बचने के द्वारा इंट्रासेल्युलर लोड परिमाणीकरण की विश्वसनीयता में सुधार करने के लिए एक सरल विधि प्रस्तावित की गई है।
यहां वर्णित assays आंतरिककरण की सीमा और NPPCs में एस ऑरियस के इंट्रासेल्युलर अस्तित्व का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान हैं, साथ ही साथ रोगाणुरोधी यौगिकों की इंट्रासेल्युलर प्रभावकारिता 6,15,16। दोनों परख प्रोटोकॉल में कुछ कदम महत्वपूर्ण हो सकता है. स्वास्थ्य की स्थिति और कोशिकाओं के घनत्व को स्वतंत्र प्रयोगों के बीच पूरी तरह से नियंत्रित और सुसंगत होना चाहिए। लक्षित सैद्धांतिक एमओआई के करीब एक वास्तविक एमओआई प्राप्त करने के लिए बैक्टीरियल इनोकुलम को सावधानीपूर्वक मानकीकृत किया जाना चाहिए। सामान्य तौर पर, इस बात का ध्यान रखा जाना चाहिए कि पिपेटिंग करते समय किसी भी कोशिका को अलग न किया जाए। लाइसोस्टॉफिन और एंटीबायोटिक दवाओं को हटाने के लिए धोने ईपीए में महत्वपूर्ण कदम हैं। प्रोटीनेज के का उपयोग इस चरण में सुधार करने के लिए पाया गया है जब कोई एंटीबायोटिक का उपयोग नहीं किया जाता है (नीचे देखें)। अंतिम लेकिन कम से कम नहीं, कोशिकाओं को प्रत्येक अच्छी तरह से पूरी तरह से अलग किया जाना चाहिए और एस ऑरियस इंट्रासेल्युलर लोड को मज़बूती से मापने के लिए लाइसिस बफर के साथ इनक्यूबेशन के बाद पूरी तरह से homogenized किया जाना चाहिए।
कुछ उदाहरणों में, समस्याओं का सामना करना पड़ सकता है, और कई बिंदुओं को पहले चेक किया जाना चाहिए। पुनरुत्पादन की कमी के मामले में, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि एस ऑरियस clumps बना सकते हैं, absorbance गलत द्वारा परिमाणीकरण बना सकते हैं। बैक्टीरिया के clumping centrifugation और धोने के चरणों द्वारा बढ़ाया जा सकता है यदि संस्कृति माध्यम को प्रतिस्थापित किया जाना है (उदाहरण के लिए, एक स्रावित प्रोटीन को खत्म करने के लिए)। बैक्टीरियल सस्पेंशन का तेजी से उपयोग किया जाना चाहिए क्योंकि बैक्टीरिया कमरे के तापमान पर बढ़ते रहते हैं। गलत भंडारण की स्थिति, संस्कृति मीडिया में एंजाइम गतिविधि के लिए सबऑप्टिमल पीएच, बैचों और प्रदाताओं के बीच एंजाइमेटिक गतिविधि में परिवर्तनशीलता, और विशिष्ट विकास की स्थिति में कुछ उपभेदों की लाइसोस्टॉफिन संवेदनशीलता की कमी के कारण लाइसोस्टेफिन प्रभावकारिता कम हो सकती है। फिनोल लाल रंग में थोड़ा बैक्टीरियोस्टेटिक प्रभाव हो सकता है, खासकर जब संस्कृति माध्यम बढ़ते बैक्टीरिया के लिए उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट शोरबा की तुलना में पोषक तत्वों में अपेक्षाकृत खराब होता है। इस प्रकार, फिनोल लाल के बिना एक सेल संस्कृति माध्यम का उपयोग करने की सलाह दी जाती है, जो पृष्ठभूमि शोर को कम करके प्रतिदीप्ति सूक्ष्म टिप्पणियों में भी सुधार करता है।
यद्यपि यह विधि विभिन्न उपभेदों के इंट्रासेल्युलर भाग्य का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है, विधि की कुछ सीमाओं पर विचार किया जाना चाहिए। एक बहुत ही उच्च MOI का उपयोग NPPCs द्वारा internalization की क्षमता अधिभार और परीक्षण किए गए विभिन्न उपभेदों के बीच अंतर को स्तर कर सकते हैं। सबसे साइटोटोक्सिक उपभेदों के आंतरिककरण की सीमा को कम करके आंका जा सकता है क्योंकि लाइसोस्टाफिन (या एंटीबायोटिक्स) तेजी से क्षतिग्रस्त कोशिकाओं द्वारा जारी किए जाने वाले एस ऑरियस को नष्ट कर देता है। इस प्रकार, विस्तारित अवधि के साथ प्रयोग (यानी, एंटीबायोटिक दवाओं के इंट्रासेल्युलर अस्तित्व या इंट्रासेल्युलर गतिविधि का अध्ययन करने के लिए) कम साइटोटॉक्सिसिटी के साथ उपभेदों के साथ स्थापित करना आसान है। इसलिए, इनक्यूबेशन समय और MOI को तनाव, सेल प्रकार और प्रयोगात्मक उद्देश्य के अनुसार सटीक रूप से समायोजित किया जाना चाहिए।
लाइसोस्टाफिन के उपयोग के साथ यहां वर्णित विधि जेंटामाइसिन पर आधारित लोगों की तुलना में अधिक विश्वसनीय है क्योंकि, लाइसोस्टाफिन के विपरीत, जेंटामाइसिन मेजबान कोशिकाओं द्वारा आंतरिक हो जाता है13। अन्य लाभ lysostaphin निष्क्रिय करने की संभावना है। Lysostaphin गतिविधि के निषेध किम एट al.13 द्वारा EDTA के उपयोग के साथ जस्ता आयनों या 1,10-phenanthroline chelate करने के लिए सूचित किया गया था; हालांकि, बैक्टीरिया के चढ़ाना से पहले एंजाइम को हटाने के लिए अभी भी गहन वॉश की आवश्यकता होती है। यहां, प्रोटीनेज के लाइसोस्टैफिन की तेजी से निष्क्रियता को सक्षम बनाता है। हमने देखा कि कोशिकाएं संस्कृति प्लेट से अलग हो जाती हैं जब वे इंट्रासेल्युलर एस ऑरियस के गुणन के कारण भारी रूप से संक्रमित हो जाते हैं। अंतिम धोने के चरण को छोड़कर, आईईपीए विधि ने तकनीकी हैंडलिंग को बहुत सरल बना दिया और ढीले अनुयायी या पहले से ही अलग कोशिकाओं में आंतरिक बैक्टीरिया की वसूली को सक्षम किया।
आईईपीए में उपयोग किए जाने वाले अधिक केंद्रित अभिकर्मकों और बफर ने भी पिपेटिंग प्रयास को कम करने और कोशिकाओं के नुकसान को कम करने में मदद की। इसके अलावा, आईईपीए का उपयोग निलंबन में कोशिकाओं के साथ-साथ ऑर्गेनोइड्स के साथ किया जा सकता है जिन्हें धोना मुश्किल है। अंत में, एंजाइम संरक्षण assays internalization की सीमा और एस aureus के इंट्रासेल्युलर भाग्य के अध्ययन को सक्षम करते हैं, साथ ही साथ विभिन्न इन विट्रो मॉडल के साथ रोगाणुरोधी दवाओं की इंट्रासेल्युलर गतिविधि। आंतरिककरण और साइटोटॉक्सिसिटी के बीच संबंधों को बेहतर ढंग से चिह्नित करने के लिए सुधार किए जाने चाहिए ताकि सेल के अंदर एस ऑरियस तक पहुंचने में सक्षम दवाओं के विकास के महत्व की बेहतर सराहना की जा सके।
The authors have nothing to disclose.
एस ऑरियस उपभेदों SF8300 WT और SF8300 ΠfnbA / B उदारता से प्रोफेसर Binh Diep (कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन फ्रांसिस्को, संयुक्त राज्य अमेरिका) द्वारा उपहार में दिए गए थे। इस काम को ल्यों विश्वविद्यालय के लिए फाउंडेशन के तत्वावधान में फिनोवी एसोसिएशन (#AO13 फिनोवीआई) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
24-well plate | CORNING-FALCON | 353047 | |
A549 cell line | ATCC | CCL-185 | |
Acetate buffer solution pH 4.6 | Fluka | 31048 | Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate. |
AMBICIN (Recombinant lysostaphin) | AMBI | LSPN-50 | Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage. |
COS – Colombia agar + 5% sheep blood | Biomerieux | 43049 | Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead. |
Densitometer WPA CO8000 | Biochrom Ltd. | 80-3000-45 | Cell density meter |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red | Sigma-Aldrich | D6429 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red | Sigma-Aldrich | D1145 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | D8662 | |
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Easyspiral dilute | Interscience | 414000 | Automatic diluter and spiral plater |
Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
HaCaT cell line | Cell lines service (CLS) | 300493 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water | Fisher scientific | 11534886 | |
Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water | Invitrogen | P3566 | |
Proteinase K, recombinant 20 mg/mL | Eurobio | GEXPRK01-B5 | > 30 U/mg, lot 901727 |
Scan 4000 | Interscience | 438000 | Automatic colony counter |
Sterile water | OTEC | 600500 | |
T-75 culture flask | CORNING-FALCON | 353136 | |
TC20 Automated cell counter | Biorad | 1450102 | Automatic cell counter |
Tris 1 M pH 8.0 | Invitrogen | AM9855G | Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Trypsin – EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | 0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
Wide-field fluorescence microscope | Nikon | Ti2 |