이 프로토콜은 황색포도상구 균 의 내재화의 범위와 인간 숙주 세포 내부에서 살아남을 수있는 능력뿐만 아니라 항균 화합물의 세포 내 효능을 연구하는 방법을 설명하는 것을 목표로합니다.
황색포도상구균은 진핵세포로의 내화를 촉발하고 다른 세포체 구획 내부에서 살아남기 위해 독성 요인을 표현한다. 이 논문은 S. 아우레우스 내재화의 정도와 부착비 전문식 세포(NPPC)에서의 세포내 생존의 정도와 항균 화합물의 세포 내 효능을 연구하기 위한 효소 보호 분석서를 설명합니다. NPPC는 100% 합류에 도달할 때까지 멀티 웰 플레이트에서 재배됩니다. S. 아우레우스 배양은 세포 배양 배지에서 하룻밤 사이에 재배된다. 세균현탁액은 감염의 조절된 복합성에서 세포를 접종하기 위해 잘 당 세포의 수에 따라 희석된다. 접종된 세포는 NPPC에 의해 박테리아가 내면화될 수 있도록 2시간 동안 배양되며, 그 다음에리소스타핀이 세포외 박테리아를 선택적으로 죽이기 위해 배양 배지에 첨가된다. 리소스타핀은 나머지 실험을 위한 배양 배지에 존재한다.
이 시점에서, 감염된 세포는 S. 아우레우스에 대하여 그들의 세포내 활동을 평가하기 위하여 항균 화합물로 배양될 수 있었습니다. 다음으로, 세포는 약물을 제거하기 위해 세 번 세척되고, 세포 내 S. 아우레우스 하중은 다음 천판에 배양하여 정량화된다. 대안적으로, 세포 내 생존 및 세포 독성에 관여하는 포도상 구균 독성 인자를 연구하기 위해 리소스타핀은 세척 단계의 필요성을 제거하기 위해 단백질 효소 K로 비활성화 될 수 있습니다. 이 팁은 세포 내 세균 부하 정량화의 신뢰성을 향상, 세포가 세포 내 S. 아우레우스의 곱셈 때문에 심하게 감염 될 때 배양 판에서 분리하는 경향이 특히. 이러한 프로토콜은 거의 모든 유형의 응고형 NPPC및 오르가노이드와 같은 3D 세포 배양 모델과 함께 사용할 수 있습니다.
황색포도상구균은 생명을 위협하는 병원체이자 피부의 막다른 박테리아와 전 세계 20억 명의 개인을 식민지화하는 점막입니다1. 인간에서, S. 아우레우스의 비강 운반체는 마차의 그들의 자신의 긴장으로 감염의 증가한 리스크가 있습니다; 그러나, S. 아우레우스 점막 마차의 다인적 결정요인은 아직도 불분명1,2. 급성 감염 이외에, 환자는 또한 치료하기 위하여 수시로 도전적인 만성 S. aureus 감염을 개발할 수 있습니다3. 식민지화 와 감염 도중 호스트 병원체 상호 작용의 더 나은 이해는 새로운 치료 전략을 개발하고 참을성 있는 관리를 향상을 위해 중요합니다.
시험관내에서, S. 아우레우스는 α5β1 integrin4를 발현하는 숙주 세포로 의 내화를 유발할 수 있다. 숙주 세포 표면에서 발현된 S. 아우레우스, fibronectin 및 β1 내테그린의 세포 벽에 고정된 황색엽 섬유네크틴 결합 단백질 간의 삼자 상호작용은 각질, 태아 세포 및 자궁 내세포와 같은 NPPC내세의 주요 경로로 잘 알려져 있다. 최근 연구에 따르면 S. 아우레우스는 비강 식민지 화 5,6 및 감염 시 인간 세포 내부에서 발견될 수 있습니다. 그러나, S. 아우레우스 감염의 병인에 있는 세포내 저수지의 역할은 불분명합니다. 숙주 세포는 면역 계통8 및 대부분의 항균 화합물 6,9모두에서 보호되는 S. 아우레우스를 위한 피난처로 작동할 수 있었습니다.
1980년대 초 프록터10 에 의해 기술된 리소스타핀 보호 분석법은 S. 아우레우스 분리의 내화에 관여하는 세균및 호스트 요인의 연구를 가능하게 합니다. 리소스타핀은 황색포도상구균 시뮬란에 의해 생성된 박테리아로, 항생제 내성 균주를 포함하여 거의 모든 S. 아우레우스 분리에 대한 강력한 활성을 나타낸다11. Lysostaphin만 실행 가능한 세포 내 박테리아의 계산을 가능하게 하기 위하여 세포외 세포 S. 아우레우스 를 파괴하는 데 사용되었습니다12. 이 기술은 널리 사용되었으며 S. 아우레우스의 여러 독성 요인의 발견에 기여했습니다. 겐타마이신은 단독으로 리소스타핀과 결합되어 세포내 박테리아를 연구하는 데도 널리 사용됩니다.
그러나, 최근 연구는 gentamycin 진핵 세포에 입력 하 고 시간 및 농도 의존 방식으로 내면화 된 박테리아에 도달 하는 것으로 나타났다13. 이 연구는 또한 리소스타핀이 진핵 세포를 입력하지 않는다는 것을 보여주었으며, 리소스타핀 기반 효소 보호 분석(EPA)이 culture13에 의한 세포내 S. 아우레우스 부하를 정량화하는 가장 정확한 분석임을 확인하였다. 세포 외 박테리아 (예 : 리소 스타핀 또는 젠타마이신)를 파괴하는 데 사용되는 화합물에 관계없이, 그것은 천 접시에 세포 내 S. 아우레우스를 도금하기 전에 세포를 세척하여 제거해야합니다. 연속된 세차는 세포의 분리 귀착될 수 있습니다, 특히 가난한 부착 세포 (예를 들면, 심하게 감염된 세포), 세포 내 S. 아우레우스 부하의 과소 평가로 이끌어 낼 것입니다. 이 논문은 EPA가 세포내 S. 아우레우스 부하를 정량화하고 체외 모델을 사용하여 항균 화합물의 세포 내 효능을 측정하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 자세히 설명합니다. 특히, 집중적 세정제를 피함으로써 세포내 하중 정량화의 신뢰성을 향상시키는 간단한 방법이 제안되었다.
여기에 설명된 아스약은 NPPC에서 S. 아우레우스의 내재화 및 세포 내 생존의 정도뿐만 아니라 항균 화합물6,15,16의 세포 내 효능을 연구하는 데 유용합니다. 두 분석 프로토콜의 일부 단계는 중요할 수 있습니다. 건강 상태와 세포의 밀도는 독립적 인 실험 사이에 완벽하게 제어되고 일치해야합니다. 세균성 접종은 표적 이론적 MOI에 가까운 실제 MOI를 얻기 위해 신중하게 표준화되어야 합니다. 일반적으로, 파이펫을 하는 동안 셀을 분리하지 않도록주의해야 합니다. 리소스타핀과 항생제를 제거하는 세하는 것은 EPA에서 중요한 단계입니다. 단백질 AK의 사용은 항생제가 사용되지 않는 때이 단계를 개선하기 위해 발견되었습니다 (아래 참조). 마지막으로, 세포는 각각 의 우물에서 완전히 분리되어야하며 S. 아우레우스 내 세포 부하를 안정적으로 정량화하기 위해 용해 버퍼로 인큐베이션 후 완전히 균질화되어야합니다.
경우에 따라 문제가 발생할 수 있으며 여러 점을 먼저 확인해야 합니다. 재현성이 부족한 경우 , S. 아우레우스 가 덩어리를 형성하여 흡수력에 의한 정량화를 부정확하게 만들 수 있다는 점을 명심해야 합니다. 박테리아의 응집력은 배양 배지를 교체할 경우 원심분리 및 세척 단계에 의해 증가할 수 있다(예를 들어, 분비단백질을 제거하기 위한). 박테리아가 실온에서 계속 자라기 때문에 세균 현탁액을 신속하게 사용해야 합니다. 리소스타핀 효능은 잘못된 저장 조건, 배양 매체의 효소 활성에 대한 최적이 아닌 pH, 배치와 공급자 간의 효소 활성의 가변성, 특정 성장 조건에서 일부 균주의 리조스타핀 감도 부족으로 인해 감소할 수 있다. 페놀 레드는 박테리아 성장에 사용되는 전형적인 국물에 비해 배양 배지가 영양소가 상대적으로 좋지 않은 경우 약간의 박테리오정성 효과를 가질 수 있습니다. 따라서, 페놀 레드 없이 세포 배양 배지를 사용하는 것이 바람직하며, 이는 또한 배경 소음을 감소시킴으로써 형광 현미경 관찰을 향상시킨다.
이 방법은 다른 균주의 세포 내 운명을 연구하는 귀중한 도구이지만, 방법의 일부 한계를 고려해야한다. 매우 높은 MOI를 사용하면 NPPC에 의한 내재화 기능을 과부하시키고 테스트된 다양한 균주의 차이점을 평준화할 수 있습니다. 리소스타핀 (또는 항생제)이 손상된 세포에 의해 방출되는 S. 아우레우스 를 급속히 파괴하기 때문에 대부분의 세포 독성 균주의 내화의 정도는 과소 평가 될 수 있습니다. 따라서, 확장 된 기간 (즉, 항생제의 세포 내 생존 또는 세포 내 활성을 연구하기 위해)를 가진 실험은 낮은 세포 독성을 가진 긴장으로 설정하는 것이 더 쉽습니다. 따라서, 인큐베이션 시간 및 MOI는 스트레인 독성, 세포 유형 및 실험 목표에 따라 정확하게 조정되어야 한다.
리소스타핀을 사용하여 여기에 기재된 방법은 리소스타핀과 달리 젠타미신에 기초하여 보다 더 신뢰할 수 있기 때문에, 젠타미신은 숙주 세포에 의해 내면화되는 경향이 있다13. 다른 장점은 리소스타핀을 비활성화 할 수있는 가능성입니다. 리소스타핀 활성의 억제는 김 외 13 에 의해 아연 이온 또는 1,10-페난트로인을 chelate에 EDTA를 사용하여 보고하였다. 그러나, 집중적인 세정제는 박테리아의 도금 하기 전에 효소를 제거 하는 데 여전히 필요. 여기서, 단백질Ae K는 리소스타핀의 급속한 불활성화를 가능하게 합니다. 우리는 세포가 세포 내 S. 아우레우스의 곱셈 때문에 심하게 감염될 때 배양 판에서 분리하는 경향이 있다는 것을 관찰했습니다. 최종 세척 단계를 건너뛰면 iEPA 방법은 기술적 취급을 크게 단순화하고 느슨하게 부착된 또는 이미 분리된 세포에서 내화된 박테리아의 회수를 가능하게 했습니다.
iEPA에 사용되는 농축 시약 및 버퍼는 파이펫 팅 노력을 줄이고 셀 손실을 최소화하는 데 도움이 되었습니다. 또한 iEPA는 세포와 함께 현탁액뿐만 아니라 세척이 어려운 오르가노이드와 함께 사용할 수 있습니다. 결론적으로, 효소 보호 작용은 S. 아우레우스의 내재화 정도및 세포내 운명뿐만 아니라 체외 모델이 다른 항균제약물의 세포내 활성 에 대한 연구를 가능하게 한다. 개선은 더 나은 세포 내부 S. 아우레우스 에 도달 할 수있는 약물을 개발의 중요성을 이해하기 위해 내면화와 세포 독성 사이의 관계를 특성화하기 위해 이루어져야합니다.
The authors have nothing to disclose.
S. 아우레우스 균주 SF8300 WT 및 SF8300 ΔfnbA/B는 빈 디프 교수(미국 캘리포니아 대학)가 아낌없이 재능이 있었습니다. 이 작품은 리옹 대학 재단의 후원하에 FINOVI 협회 (#AO13 FINOVI)의 보조금에 의해 지원되었다.
24-well plate | CORNING-FALCON | 353047 | |
A549 cell line | ATCC | CCL-185 | |
Acetate buffer solution pH 4.6 | Fluka | 31048 | Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate. |
AMBICIN (Recombinant lysostaphin) | AMBI | LSPN-50 | Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage. |
COS – Colombia agar + 5% sheep blood | Biomerieux | 43049 | Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead. |
Densitometer WPA CO8000 | Biochrom Ltd. | 80-3000-45 | Cell density meter |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red | Sigma-Aldrich | D6429 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red | Sigma-Aldrich | D1145 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | D8662 | |
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Easyspiral dilute | Interscience | 414000 | Automatic diluter and spiral plater |
Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
HaCaT cell line | Cell lines service (CLS) | 300493 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water | Fisher scientific | 11534886 | |
Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water | Invitrogen | P3566 | |
Proteinase K, recombinant 20 mg/mL | Eurobio | GEXPRK01-B5 | > 30 U/mg, lot 901727 |
Scan 4000 | Interscience | 438000 | Automatic colony counter |
Sterile water | OTEC | 600500 | |
T-75 culture flask | CORNING-FALCON | 353136 | |
TC20 Automated cell counter | Biorad | 1450102 | Automatic cell counter |
Tris 1 M pH 8.0 | Invitrogen | AM9855G | Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Trypsin – EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | 0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red |
Wide-field fluorescence microscope | Nikon | Ti2 |