Резонансные анализы переноса энергии Фёрстера с временным разрешением для измерения эндогенных фосфорилированных белков STAT в клетках человека
Summary
Описаны протоколы клеточного анализа резонансного переноса энергии Фёрстера с временным разрешением для простой, специфической, чувствительной и надежной количественной оценки эндогенного фосфорилированного преобразователя сигнала и активатора транскрипции (STAT) 1/3/4/5/6 белков в клеточных лизатах в формате 384 лунки.
Abstract
Сигнальный путь Janus kinase (JAK)/сигнальный преобразователь и активатор транскрипции (STAT) играет решающую роль в опосредовании клеточных реакций на цитокины и факторы роста. Белки STAT активируются фосфорилированием тирозина, опосредованным главным образом JAK. Аномальная активация сигнальных путей STAT связана со многими заболеваниями человека, особенно раком и иммунными состояниями. Поэтому возможность мониторинга фосфорилирования белка STAT в нативной клеточной сигнальной среде важна как для академических исследований, так и для исследований по открытию лекарств. Традиционные форматы анализа, доступные для количественной оценки фосфорилированных белков STAT, включают вестерн-блоттинг и иммуноферментный анализ (ИФА). Эти гетерогенные методы являются трудоемкими, малопроизводительными и часто ненадежными (специфическими) в случае западного блоттинга. Однородные (без стирки) методы доступны, но остаются дорогими.
Здесь представлены подробные протоколы для чувствительного, надежного и экономически эффективного измерения в формате 384 скважин эндогенных уровней фосфорилированных STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) и STAT6 (Y641) в лизатах клеток из адгезивных или суспензионных ячеек с использованием новой платформы резонансного переноса энергии Förster (TR-FRET) с временным разрешением THUNDER. Рабочий процесс для анализа сотовой связи прост, быстр и предназначен для высокопроизводительного скрининга (HTS). Протокол анализа является гибким, использует малообъемный образец (15 мкл), требует только одного этапа добавления реагента и может быть адаптирован к приложениям с низкой и высокой пропускной способностью. Каждый фосфо-STAT сэндвич иммуноанализ проверяется в оптимизированных условиях с известными агонистами и ингибиторами и генерирует ожидаемые значения фармакологии и Z’-фактора. Поскольку анализы TR-FRET являются ратиометрическими и не требуют этапов промывки, они обеспечивают гораздо лучшую воспроизводимость, чем традиционные подходы. Вместе этот набор анализов предоставляет новые экономически эффективные инструменты для более полного анализа специфических фосфорилированных белков STAT после обработки клеток, а также скрининга и характеристики специфических и селективных модуляторов сигнального пути JAK / STAT.
Introduction
Сигнальный путь JAK/STAT играет ключевую роль в опосредовании клеточных реакций на различные цитокины, интерфероны, факторы роста и связанные с ними молекулы1,2. Связывание этих лигандов со специфическими рецепторами клеточной поверхности приводит к активации JAK, которые, в свою очередь, активируют белки STAT путем фосфорилирования специфических остатков тирозина. Фосфорилирование STAT приводит к их димеризации и транслокации в ядро, где они оказывают свое влияние на транскрипцию регулируемых генов-мишеней. Семейство STAT состоит из семи членов: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b и STAT6. Члены играют сложную и существенную роль в регуляции физиологических клеточных процессов, включая пролиферацию, дифференцировку, апоптоз, ангиогенез и регуляцию иммунной системы. Аномальная активация сигнальных путей STAT связана со многими заболеваниями человека, особенно раком и иммунными состояниями3,4. Таким образом, способность оценивать фосфорилирование белка STAT в нативной клеточной сигнальной среде важна как для академических исследований, так и для исследований по открытию лекарств.
На сегодняшний день традиционные методы, используемые для измерения внутриклеточных уровней фосфорилированного белка, включая STATs, основаны на антителах и включают вестерн-блоттинг, ИФА и цитометрию фосфопотока. Эти гетерогенные методы являются трудоемкими, трудоемкими, трудоемкими, подверженными ошибкам, с низкой пропускной способностью и часто ненадежными (например, вопросы специфичности) в случае западного блоттинга5. Напротив, однородные анализы требуют меньшего количества экспериментальных этапов, используют меньшие объемы образцов и поддаются HTS. Существует пять коммерчески доступных платформ иммуноанализа на основе однородных клеток, которые можно использовать для количественного мониторинга JAK-зависимого фосфорилирования STATs в клеточных лизатах: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen и Lumit. Каждая из этих платформ имеет свои преимущества и недостатки.
SureFire основан на люминесцентной технологии канала кислорода, которая использует донорские и акцепторные шарики, покрытые специальным захватом пары антител, одно из которых является биотинилированным. В присутствии фосфорилированного белка два антитела приближают донорские и акцепторные шарики, что позволяет генерировать хемилюминесцентный сигнал6. Несмотря на универсальность и чувствительность, эта технология является дорогостоящей, подвержена влиянию биотина в питательной среде, очень чувствительна к температуре окружающей среды и свету и требует специального считывателя для обнаружения. HTRF и LANCE основаны на технологии TR-FRET, которая использует люминесцентные ионные комплексы лантаноидов с длительным сроком службы (хелаты европия или тербия, или криптат европия) в качестве донорских молекул и дальние красные флуорофоры в качестве молекул-акцепторов7. Когда два белково-специфических антитела, меченные донорскими или акцепторными молекулами, находятся в непосредственной близости, происходит FRET, вызывая увеличение акцепторной флуоресценции и снижение донорской флуоресценции. Эти долгоживущие флуоресцентные сигналы могут быть измерены с временным разрешением и ратиометрическим способом, чтобы уменьшить помехи анализа и повысить качество данных. Другие преимущества TR-FRET заключаются в том, что он не светочувствительн, позволяет повторять показания и демонстрирует длительную стабильность сигнала. В то время как TR-FRET широко применяется в HTS из-за его универсальности, чувствительности и высокой надежности, все коммерческие платформы анализа на основе TR-FRET являются дорогостоящими, что исключает его широкое внедрение в академических и небольших промышленных лабораториях. Анализ LanthaScreen также использует считывание на основе TR-FRET, но зависит от инженерной клеточной линии U2OS, которая стабильно экспрессирует зеленый флуоресцентный белок (GFP)-STAT1 в сочетании с меченым тербием фосфо-специфическим антителом STAT18. Помимо того, что этот метод ограничен с точки зрения выбора сигнальных белков, он требует покупки дорогостоящих трансфектированных клеточных линий, снижения его применимости и увеличения возможности экспериментальных артефактов. Lumit – это универсальная платформа для биолюминесцентного иммуноанализа, которая использует вторичные антитела (против мышей и кроликов), химически меченые малыми и большими субъединицами NanoBit Люциферазы NanoLuc9. Связывание двух первичных антител с целевым белком приводит вторичные антитела в близость, образуя активный фермент, который генерирует сигнал люминесценции. В то время как люминесценция, как правило, является чувствительным и надежным считыванием, потребность в первичных антителах, выращенных у двух разных видов, ограничивает выбор конструкции анализа. Кроме того, использование вторичных антител в сложных матрицах образцов может быть склонно к анализу интерференции.
Таким образом, по-прежнему существует потребность в надежной, быстрой, но доступной клеточной аналитической платформе для измерения отдельных фосфорилированных и общих белков STAT способом, совместимым с HTS. Для удовлетворения этой потребности была разработана новая высокопроизводительная клеточная иммунологическая платформа, основанная на усовершенствованной технологии TR-FRET (THUNDER) и предназначенная для обеспечения простого, чувствительного, надежного и экономически эффективного измерения эндогенно экспрессированных внутриклеточных белков (фосфорилированных или общих) в клеточных лизатах. Преимущества этой технологии связаны с комбинацией пары донор/акцептор FRET, демонстрирующей исключительную спектральную совместимость и сигнал TR-FRET, строго проверенные антитела и оптимизированные буферы лизиса. Эти анализы форматируются как сэндвич-иммуноанализы и используют простой трехэтапный рабочий процесс (рисунок 1). Клетки сначала обрабатывают для модуляции фосфорилирования белка, а затем лизируют специфическим буфером лизиса, предусмотренным в наборе. Целевой фосфорилированный или общий белок STAT в клеточном лизате обнаруживается на стадии добавления и инкубации реагента с парой флуорофор-меченых антител, которые распознают различные эпитопы на белке-мишени (рисунок 2). Одно антитело маркируется донором хелата европия (Eu-Ab1), в то время как второе антитело маркируется дальним красным акцепторным флуорофором (FR-Ab2). Два меченых антитела связываются с белком в растворе, в результате чего две метки находятся в непосредственной близости. Возбуждение донорского хелата европия при 320 или 340 нм запускает FRET к акцептору, который излучает долгоживущий сигнал TR-FRET на 665 нм, пропорциональный концентрации белка-мишени (фосфорилированного или общего) в клеточном лизате.
Рисунок 1: Рабочий процесс анализа TR-FRET. Рабочий процесс состоит из трех этапов: обработка клеток, лизис клеток и обнаружение белка с использованием TR-FRET. В протоколе двухпластинчатого анализа лизаты переносятся на белую 384-луночную детектирующую пластину, тогда как в протоколе с одной пластиной все этапы проводятся в одной и той же белой 384-луночной детектирующей пластине (протокол «все в одной скважине»). Независимо от используемого протокола анализа, обнаружение белка выполняется в одном и том же общем объеме (20 мкл на лунку). Аббревиатура: TR-FRET = резонансный перенос энергии Фёрстера с временным разрешением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Принцип иммунологического анализа сэндвича TR-FRET. Одно антитело маркируется донором хелата европия (Eu-Ab1), а второе — дальнокрасым малым флуорофорным акцептором (FR-Ab2). Два меченых антитела связываются специфически с различными эпитопами на белке-мишени (фосфорилированном или общем) в клеточном лизате, в результате чего два флуорофора находятся в непосредственной близости. Возбуждение донора хелата европия при 320 или 340 нм запускает FRET от донора к молекулам-акцепторам, которые в свою очередь излучают сигнал на 665 нм. Этот сигнал пропорционален концентрации белка в клеточном лизате. При отсутствии специфического белка-мишени донорский и акцепторный флуорофоры находятся слишком далеко друг от друга для возникновения FRET. Сокращения: FRET = резонансный перенос энергии Фёрстера; TR-FRET = фрет с временным разрешением; Ab = антитело; FR = дальний красный; Eu – хелат европия; P = фосфорилирование. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Здесь представлены подробные протоколы для измерения в формате 384 лунки внутриклеточных уровней фосфорилированных STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) и STAT6 (Y641) вместе с общим количеством STAT1, STAT3, STAT5 и STAT6 в лизатах клеток из адгезивных или суспензионных ячеек с использованием платформы THUNDER TR-FRET. Эти протоколы определяют этапы обработки клеток, лизиса и обнаружения целевого белка на основе TR-FRET с использованием либо протокола передачи двух пластин, либо протокола «все в одной скважине». Эти клеточные анализы применяются для определения фармакологического профиля известных активаторов и ингибиторов пути JAK/STAT. Продемонстрирована надежность и пригодность выбранных анализов для ХТШ. Наконец, обсуждаются ключевые эксперименты по оптимизации анализа, а также рекомендации по устранению неполадок анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
По сравнению с традиционными методами анализа фосфопротеинов, такими как западное блоттинг и методы на основе ИФА, рабочий процесс для клеточного анализа THUNDER TR-FRET прост и быстр, использует образец малого объема (15 мкл), предназначен для HTS в формате 384 скважины и очень поддается автомати…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Никакой.
Materials
| 96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile | Corning | 3595 | This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used |
| 384-well microplate, white, low-volume | PerkinElmer | 6007290 | This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used |
| A431 cell line | ATCC | CRL-1555 | |
| Adhesive microplate seal | PerkinElmer | 6050185 | |
| DMSO | Fisher | D159-4 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Wisent | 319-005-CL | THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red |
| EnVision Xcite Multilabel plate reader | PerkinElmer | 2104-0020A | The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option |
| Erlotinib hydrochloride | Sigma | CDS022564 | |
| Falcon tissue culture treated flasks | Fisher | 13-680-65 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 098-150 | |
| HeLa cell line | ATCC | CCL-2 | |
| JAK Inhibitor 1 | Cayman Chemical | 15146 | |
| Orbital plate shaker | Many options available | Not applicable | |
| Recombinant human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant human IFNα2b | ProSpec | CYT-460 | |
| Recombinant human IL-4 | R&D Systems | 204-IL | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Wisent | 350-007-CL | THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red |
| THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT1PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT3PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) + Total STAT4 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT4PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT5PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT6PT-500 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Wisent | 325-542-CL | |
| U266B1 cell line | ATCC | TIB-196 | |
| Ultrapure water | NA | NA | Use Milli-Q grade water (18 MΩ.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer |
References
- Villarino, A., Kanno, Y., O’Shea, J. Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system. Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).
- Hammarén, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease. Cytokine. 118, 48-63 (2019).
- O’Shea, J. J., et al. The JAK-STAT pathway: impact on human disease and therapeutic intervention. Annual Review of Medicine. 66, 311-328 (2015).
- Verhoeven, Y., et al. et al. potential and controversy of targeting STAT family members in cancer. Seminars in Cancer Biology. 60 (2), 41-56 (2020).
- Gilda, J. E., et al. et al. blotting inaccuracies with unverified antibodies: need for a Western blotting minimal reporting standard (WBMRS). PLoS One. 10 (8), 0135392 (2015).
- Binder, C., et al. et al. and utilization of the SureFire phospho-STAT5 assay for a cell-based screening campaign. Assay and Drug Development Technologies. 6 (1), 27-37 (2008).
- Ayoub, M. A., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence-based assay to monitor extracellular signal-regulated kinase signaling in a high-throughput format. Frontiers in Endocrinology. 5, 94 (2014).
- Robers, M. B., Machleidt, T., Carlson, C. B., Bi, K. Cellular LanthaScreen and beta-lactamase reporter assays for high-throughput screening of JAK2 inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 6 (4), 519-529 (2008).
- Hwang, B., Engel, L., Goueli, S. A., Zegzouti, H. A. Homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway regulation. Communications Biology. 3 (8), 1-12 (2020).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Osmond, R. I. W., Das, S., Crouch, M. F. Development of cell-based assays for cytokine receptor signaling, using an AlphaScreen SureFire assay format. Analytical Biochemistry. 403 (1-2), 94-101 (2010).
- Haan, C., et al. Jak1 has a dominant role over Jak3 in signal transduction through γc-containing cytokine receptors. Chemistry & Biology. 18 (3), 314-323 (2011).
- Kim, Y., Apetri, M., Luo, B., Settleman, J. E., Anderson, K. S. Differential effects of tyrosine kinase inhibitors on normal and oncogenic EGFR signaling and downstream effectors. Molecular Cancer Research. 13 (4), 765-774 (2015).
- Qian, J., et al. Comparison of two homogeneous cell-based kinase assays for JAK2 V617F: SureFire pSTAT5 and GeneBLAzer fluorescence resonance energy transfer assays. ASSAY and Drug Development Technologies. 10 (2), 212-217 (2012).
- Iversen, P. W., et al., Markossian, S., et al. HTS assay validation. Assay Guidance Manual. , (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8, 3029 (2018).
