마이크로전극 어레이를 이용한 척추 노셉티브 회로에서의 네트워크 활동 기록
Summary
척수 등쪽 경적에서 네트워크 수준의 nociceptive 활성을 조사하기 위한 마이크로전극 어레이 기술과 4-아미노피리딘-유도된 화학적 자극의 조합된 사용이 개략적으로 설명된다.
Abstract
척수 등쪽 뿔 (DH) 내의 특정 유형의 뉴런의 역할과 연결성은 척추 통증 처리를 뒷받침하는 회로에 대한 점점 더 상세한 시각을 제공하기 위해 빠른 속도로 묘사되고 있습니다. 그러나, DH에서의 더 넓은 네트워크 활성에 대한 이러한 연결의 효과는 대부분의 연구가 단일 뉴런 및 작은 미세 회로의 활성에 초점을 맞추기 때문에 덜 잘 이해되고 있다. 대안으로, 많은 셀에 걸친 전기적 활동을 모니터링할 수 있는 미세전극 어레이(MEA)의 사용은 신경 활동의 높은 공간적 및 시간적 분해능을 제공한다. 여기에서, 4-아미노피리딘 (4-AP)으로 DH 회로를 화학적으로 자극함으로써 유도된 DH 활성을 연구하기 위해 마우스 척수 절편과 함께 MEAs의 사용이 기술된다. 생성된 리듬 활성은 피상적 DH로 제한되고, 시간이 지남에 따라 안정하며, 테트로도톡신에 의해 차단되고, 상이한 슬라이스 배향에서 조사될 수 있다. 함께,이 제제는 순진한 동물, 만성 통증의 동물 모델 및 유 전적으로 변경된 nociceptive 기능을 가진 마우스의 조직에서 DH 회로 활성을 조사하는 플랫폼을 제공합니다. 또한, 4-AP 자극 척수 절편에서의 MEA 기록은 척수 DH에서의 활성을 방해하는 신규한 항항민성 화합물의 능력을 평가하기 위한 신속한 스크리닝 도구로서 사용될 수 있다.
Introduction
척수 DH 내의 특정 유형의 억제 및 흥분성 인터뉴런의 역할은 빠른 속도로 밝혀지고 있습니다 1,2,3,4. 함께, 인터뉴런은 DH에서 뉴런의 95% 이상을 차지하며 nociception을 포함한 감각 처리에 관여합니다. 또한, 이러한 인터뉴런 회로는 말초 신호가 신경축을 상승시켜 뇌에 도달하고 통증 5,6,7에 대한 인식에 기여하는지 여부를 결정하는 데 중요합니다. 현재까지 대부분의 연구는 시험관내 세포 내 전기 생리학, 신경 해부학 표지 및 생체 내 행동 분석 1,3,8,9,10,11,12,13,14의 조합을 사용하여 단일 세포 또는 전체 유기체 수준의 분석에서 DH 뉴런의 역할을 조사했습니다. . 이러한 접근법은 통증 처리에서 특정 뉴런 집단의 역할에 대한 이해를 상당히 향상 시켰습니다. 그러나 특정 세포 유형과 작은 매크로 회로가 마이크로 회로 수준에서 많은 뉴런 집단에 어떻게 영향을 미치는지 이해하여 DH의 결과, 행동 반응 및 통증 경험을 형성하는 데 차이가 남아 있습니다.
매크로 회로 또는 다셀 레벨 기능을 조사할 수 있는 기술 중 하나는 마이크로전극 어레이(MEA)15,16이다. MEA는 수십 년 동안 신경계 기능을 조사하는 데 사용되어 왔습니다17,18. 뇌에서 그들은 신경 발달, 시냅스 가소성, 약리학 적 스크리닝 및 독성 테스트17,18에 대한 연구를 촉진했습니다. 이들은 MEA의 유형에 따라 시험관내 및 생체내 적용 모두에 사용될 수 있다. 또한, MEA의 개발은 빠르게 발전해 왔으며, 현재 다양한 전극 번호와 구성을 사용할 수 있습니다19. MEA의 주요 장점은 여러 전극15,16을 통해 높은 공간 및 시간적 정확도로 많은 뉴런에서 전기 활동을 동시에 평가할 수 있다는 것입니다. 이것은 뉴런이 회로와 네트워크, 제어 조건 및 국부적으로 적용된 화합물의 존재하에 어떻게 상호 작용하는지에 대한 광범위한 판독을 제공합니다.
시험관내 DH 제제의 한 가지 과제는 진행중인 활성 수준이 전형적으로 낮다는 것이다. 여기서, 이러한 과제는 DH 회로를 화학적으로 자극하기 위해 전압 게이팅된 K+ 채널 차단제인 4-아미노프리딘(4-AP)을 사용하는 척수 DH 회로에서 해결된다. 이 약물은 이전에 급성 척수 절편의 DH와 급성 생체 내 조건20,21,22,23,24에서 리듬 동기 전기 활동을 확립하는 데 사용되었습니다. 이 실험은 4-AP 유도 활성20,21,22,23,24,25를 특성화하기 위해 단일 세포 패치 및 세포외 기록 또는 칼슘 이미징을 사용했습니다. 함께,이 연구는 리듬 4-AP 유도 활성에 대한 흥분성 및 억제 시냅스 전달 및 전기 시냅스의 요구 사항을 입증했습니다. 따라서, 4-AP 반응은 약물-유도된 에피현상이라기보다는 생물학적 관련성을 갖는 천연 폴리시냅스 DH 회로를 마스크해제하는 접근법으로 간주되어 왔다. 더욱이, 4-AP 유도 활성은 신경병증성 통증 상태로서 진통 및 항간질 약물과 유사한 반응 프로파일을 나타내며, 콘넥신20,21,22와 같은 신규한 척추 기반 진통제 표적을 제안하는데 사용되어 왔다.
여기에서, MEAs와 척추 DH의 화학적 활성화를 4-AP와 결합하여 매크로 회로 또는 네트워크 수준의 분석에서 이러한 nociceptive 회로를 연구하는 제제가 설명된다. 이 접근법은 순진하고 신경 병증적인 ‘통증과 같은’조건에서 nociceptive circuit을 조사하기위한 안정적이고 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다. 이 제제는 또한 알려진 진통제의 회로 수준 작용을 테스트하고 과민성 척수에서 새로운 진통제를 스크리닝하는 데 쉽게 적용 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
통각적 신호전달, 처리 및 통증을 특징짓는 행동 및 정서적 반응에서 척추 DH의 중요성에도 불구하고, 이 영역 내의 회로는 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다. 이 문제를 조사하는 데있어 중요한 도전은 이러한 회로 6,31,32를 구성하는 뉴런 집단의 다양성이었습니다. 광유전학과 화학유전학이 주도하는 트랜스제닉 기술의 최근…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 호주 국립 보건 의학 연구위원회 (NHMRC) (B.A.G. 및 R.J.C.에 대한 631000, 1043933, 1144638 및 1184974 보조금)와 헌터 의학 연구소 (B.A.G. 및 R.J.C.에 대한 보조금)가 자금을 지원했습니다.
Materials
| 4-aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875-5G | |
| 100% ethanol | Thermo Fisher | AJA214-2.5LPL | |
| CaCl2 1M | Banksia Scientific | 0430/1L | |
| Carbonox (Carbogen – 95% O2, 5% CO2) | Coregas | 219122 | |
| Curved long handle spring scissors | Fine Science Tools | 15015-11 | |
| Custom made air interface incubation chamber | |||
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher | 10091130 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Glucose | Thermo Fisher | AJA783-500G | |
| Horse serum | Thermo Fisher | 16050130 | |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert10 | |
| KCl | Thermo Fisher | AJA383-500G | |
| Ketamine | Ceva | KETALAB04 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14007-14 | |
| Loctite 454 Instant Adhesive | Bolts and Industrial Supplies | L4543G | |
| MATLAB | MathWorks | R2018b | |
| MEAs, 3-Dimensional | Multichannel Systems | 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8×8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart. |
| MEA headstage | Multichannel Systems | MEA2100-HS60 | |
| MEA interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot | |
| MEA net | Multichannel Systems | ALA HSG-MEA-5BD | |
| MEA perfusion system | Multichannel Systems | PPS2 | |
| MEAs, Planar | Multichannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8×8 square grid (200/30) or a 6×10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart. |
| MgCl2 | Thermo Fisher | AJA296-500G | |
| Microscope camera | Motic | Moticam X Wi-Fi | |
| Multi Channel Analyser software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| Multi Channel Experimenter software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| NaCl | Thermo Fisher | AJA465-500G | |
| NaHCO3 | Thermo Fisher | AJA475-500G | |
| NaH2PO4 | Thermo Fisher | ACR207805000 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Small spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Sucrose | Thermo Fisher | AJA530-500G | |
| Superglue | cyanoacrylate adhesive | ||
| Tetrodotoxin | Abcam | AB120055 | |
| Vibration isolation table | Newport | VH3048W-OPT | |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 S |
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