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Neurosciences

Atividade de rede de gravação em circuitos nociceptivos da coluna vertebral usando matrizes de microeletrodos

Published: February 09, 2022
doi:
10.3791/62920
, , , , , , , ,
1School of Biomedical Sciences and Pharmacy,University of Newcastle, 2School of Electrical Engineering,University of Newcastle

Summary

O uso combinado da tecnologia de matriz de microeletrodos e estimulação química induzida por 4 aminopirdina para investigar a atividade nociceptiva em nível de rede no chifre dorsal da medula espinhal é delineado.

Abstract

As funções e a conectividade de tipos específicos de neurônios dentro do chifre dorsal da medula espinhal (DH) estão sendo delineados em uma velocidade rápida para fornecer uma visão cada vez mais detalhada dos circuitos que sustentam o processamento da dor na coluna vertebral. No entanto, os efeitos dessas conexões para uma atividade de rede mais ampla no DH permanecem menos bem compreendidos porque a maioria dos estudos se concentra na atividade de neurônios únicos e microcircuitos pequenos. Alternativamente, o uso de matrizes de microeletrodos (MEAs), que podem monitorar a atividade elétrica em muitas células, proporciona alta resolução espacial e temporal da atividade neural. Aqui, descreve-se o uso de MEAs com fatias de medula espinhal de camundongos para estudar a atividade de DH induzida por circuitos dh quimicamente estimulantes com 4-aminopirridina (4-AP). A atividade rítmica resultante é restrita ao DH superficial, estável ao longo do tempo, bloqueada por tetrodotoxina, e pode ser investigada em diferentes orientações de fatias. Em conjunto, esta preparação fornece uma plataforma para investigar a atividade do circuito de DH em tecidos de animais ingênuos, modelos animais de dor crônica e camundongos com função nociceptiva geneticamente alterada. Além disso, gravações de MEA em fatias de medula espinhal estimuladas por 4-AP podem ser usadas como uma ferramenta de triagem rápida para avaliar a capacidade de novos compostos antinociceptivos para interromper a atividade na DH medular.

Introduction

Os papéis de tipos específicos de interneurônios inibitórios e excitatórios dentro da DH medula espinhal estão sendo descobertos a uma velocidade rápidade 1,2,3,4. Juntos, os interneurônios compõem mais de 95% dos neurônios no DH e estão envolvidos no processamento sensorial, incluindo a nocicepção. Além disso, esses circuitos interneurônios são importantes para determinar se os sinais periféricos ascendem ao neuroaxis para atingir o cérebro e contribuem para a percepção da dor 5,6,7. Até o momento, a maioria dos estudos investigou o papel dos neurônios DH no nível de análise unicelular ou organismo inteiro usando combinações de eletrofisiologia intracelular in vitro, rotulagem neuroanatomética e análise comportamental in vivo 1,3,8,9,10,11,12,13,14 . Essas abordagens avançaram significativamente na compreensão do papel das populações específicas de neurônios no processamento da dor. No entanto, permanece uma lacuna na compreensão de como tipos celulares específicos e pequenos macro-circuitos influenciam grandes populações de neurônios em um nível de microcircuito para posteriormente moldar a saída do DH, respostas comportamentais e a experiência de dor.

Uma tecnologia que pode investigar a função de macro-circuito ou nível multicelular é a matriz de microeletrodos (MEA)15,16. Os MEAs têm sido usados para investigar a função do sistema nervoso por várias décadas17,18. No cérebro, eles facilitaram o estudo do desenvolvimento neuronal, plasticidade sináptica, triagem farmacológica e teste de toxicidade17,18. Eles podem ser usados tanto para aplicações in vitro quanto in vivo, dependendo do tipo de MEA. Além disso, o desenvolvimento de MEAs evoluiu rapidamente, com diferentes números de eletrodos e configurações agora disponíveis19. Uma vantagem fundamental dos MEAs é sua capacidade de avaliar simultaneamente a atividade elétrica em muitos neurônios com alta precisão espacial e temporal através de múltiplos eletrodos15,16. Isso fornece uma leitura mais ampla de como os neurônios interagem em circuitos e redes, sob condições de controle e na presença de compostos aplicados localmente.

Um desafio das preparações in vitro de DH é que os níveis de atividade contínuos são tipicamente baixos. Aqui, este desafio é abordado em circuitos DH da medula espinhal usando o bloqueador de canal K+ com espaço de tensão, 4-aminopryidina (4-AP), para estimular quimicamente circuitos DH. Esta droga tem sido usada anteriormente para estabelecer atividade elétrica síncronica rítmica no DH de fatias agudas da medula espinhal e sob condições in vivo agudas 20,21,22,23,24. Esses experimentos utilizaram patch unicelular e gravação extracelular ou imagem de cálcio para caracterizar atividade induzida por 4-AP 20,21,22,23,24,25. Juntos, este trabalho demonstrou a exigência de transmissão sináptica excitatória e inibitória e sinapses elétricas para atividade rítmica induzida por 4-AP. Assim, a resposta 4-AP tem sido vista como uma abordagem que desmascara circuitos de DH polissinápticos nativos com relevância biológica e não como um epifenomenon induzido por drogas. Além disso, a atividade induzida por 4-AP exibe um perfil de resposta semelhante às drogas analgésicas e antiepilépticas como condições de dor neuropática e tem sido usada para propor novos alvos de drogas analgésicas de base espinhal, como connexins 20,21,22.

Aqui, é descrita uma preparação que combina MEAs e ativação química do DH espinhal com 4-AP para estudar este circuito nociceptivo no macro-circuito, ou nível de rede de análise. Esta abordagem fornece uma plataforma estável e reprodutível para investigar circuitos nociceptivos sob condições ingênuas e neuropáticas “semelhantes à dor”. Esta preparação também é prontamente aplicável para testar a ação em nível de circuito de analgésicos conhecidos e para exibir novos analgésicos na medula espinhal hiperativa.

Protocol

Foram realizados estudos em camundongos c57Bl/6 do sexo masculino e feminino de 3 a 12 meses. Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com o Comitê de Ética e Cuidados com Animais da Universidade de Newcastle (protocolos A-2013-312 e A-2020-002). 1. Eletrofisiologia in vitro Preparação de soluções para preparação e gravação de fatias de medula espinhal Fluido cefalorraquidiano artificialNOTA: O fluido cerebrospinal artificial (aCS…

Representative Results

Modelo de atividade de rede no chifre dorsal da medula espinhalA aplicação de 4-AP induz de forma confiável a atividade rítmica síncronica na medula espinhal DH. Tal atividade apresenta-se como aumento de EAPs e LFPs. O sinal posterior é uma forma de onda de baixa frequência, que já foi descrita nas gravações do MEA30. Alterações na atividade EAP e/ou LFP após a aplicação da droga refletem a atividade neural alterada. Exemplos de EAPs e LFPs são mostrados na <s…

Discussion

Apesar da importância da DH espinhal na sinalização nociceptiva, no processamento e nas respostas comportamentais e emocionais resultantes que caracterizam a dor, os circuitos nessa região permanecem mal compreendidos. Um dos principais desafios na investigação desta questão tem sido a diversidade de populações de neurônios que compõem esses circuitos 6,31,32. Os recentes avanços nas tecnologias transgênicas, lidera…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo National Health and Medical Research Council (NHMRC) da Austrália (bolsas 631000, 1043933, 1144638 e 1184974 para B.A.G. e R.J.C.) e o Hunter Medical Research Institute (bolsa para B.A.G. e R.J.C.).

Materials

4-aminopyridine Sigma-Aldrich 275875-5G
100% ethanol Thermo Fisher AJA214-2.5LPL
CaCl2 1M Banksia Scientific 0430/1L
Carbonox (Carbogen – 95% O2, 5% CO2) Coregas 219122
Curved long handle spring scissors Fine Science Tools 15015-11
Custom made air interface incubation chamber
Foetal bovine serum Thermo Fisher 10091130
Forceps Dumont #5 Fine Science Tools 11251-30
Glucose Thermo Fisher AJA783-500G
Horse serum Thermo Fisher 16050130
Inverted microscope Zeiss Axiovert10
KCl Thermo Fisher AJA383-500G
Ketamine Ceva KETALAB04
Large surgical scissors Fine Science Tools 14007-14
Loctite 454 Instant Adhesive Bolts and Industrial Supplies L4543G
MATLAB MathWorks R2018b
MEAs, 3-Dimensional Multichannel Systems 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8×8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart.
MEA headstage Multichannel Systems MEA2100-HS60
MEA interface board Multichannel Systems MCS-IFB 3.0 Multiboot
MEA net Multichannel Systems ALA HSG-MEA-5BD
MEA perfusion system Multichannel Systems PPS2
MEAs, Planar Multichannel Systems 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8×8 square grid (200/30) or a 6×10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart.
MgCl2 Thermo Fisher AJA296-500G
Microscope camera Motic Moticam X Wi-Fi
Multi Channel Analyser software Multichannel Systems V 2.17.4
Multi Channel Experimenter software Multichannel Systems V 2.17.4
NaCl Thermo Fisher AJA465-500G
NaHCO3 Thermo Fisher AJA475-500G
NaH2PO4 Thermo Fisher ACR207805000
Rongeurs Fine Science Tools 16021-14
Small spring scissors Fine Science Tools 91500-09
Small surgical scissors Fine Science Tools 14060-09
Sucrose Thermo Fisher AJA530-500G
Superglue cyanoacrylate adhesive
Tetrodotoxin Abcam AB120055
Vibration isolation table Newport VH3048W-OPT
Vibrating microtome Leica VT1200 S
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References

  1. Smith, K. M., et al. Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn. eLife. 8, 49190 (2019).
  2. Smith, K. M., et al. Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing. The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).
  3. Boyle, K. A., et al. Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia. Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).
  4. Browne, T. J., et al. Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32 (2020).
  5. Graham, B. A., Hughes, D. I. Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits. Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).
  6. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
  7. Hughes, D. I., Todd, A. J. Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord. Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).
  8. Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
  9. Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E. Itch and neuropathis itch. Pain. 159 (3), 603 (2018).
  10. Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
  11. Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
  12. Cheng, L., et al. Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain. Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).
  13. Peirs, C., et al. Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury. Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).
  14. Huang, J., et al. Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain. Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).
  15. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2015).
  16. Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
  17. Johnstone, A. F., et al. Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century. Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).
  18. Stett, A., et al. Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).
  19. Xu, L., et al. Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs). Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854 (2020).
  20. Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses. The Journal of Physiology. 587, 2499-2510 (2009).
  21. Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain. Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).
  22. Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro. Physiological Reports. 4 (14), 12852 (2016).
  23. Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord. Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).
  24. Semba, K., Geller, H. M., Egger, M. D. 4-Aminopyridine induces expansion of cutaneous receptive fields of dorsal horn cells. Brain Research. 343 (2), 398-402 (1985).
  25. Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Long-range oscillatory Ca2+ waves in rat spinal dorsal horn. European Journal of Neuroscience. 22 (8), 1967-1976 (2005).
  26. Egert, U., et al. A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays. Brain Research Protocols. 2 (4), 229-242 (1998).
  27. Thiebaud, P., De Rooij, N., Koudelka-Hep, M., Stoppini, L. Microelectrode arrays for electrophysiological monitoring of hippocampal organotypic slice cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 44 (11), 1159-1163 (1997).
  28. Rey, H. G., Pedreira, C., Quiroga, R. Q. Past, present and future of spike sorting techniques. Brain Research Bulletin. 119, 106-117 (2015).
  29. Satuvuori, E., et al. Measures of spike train synchrony for data with multiple time scales. Journal of Neuroscience Methods. 287, 25-38 (2017).
  30. Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays. 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).
  31. Hughes, D. I., et al. Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn. The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).
  32. Peirs, C., Seal, R. P. Neural circuits for pain: recent advances and current views. Science. 354 (6312), 578-584 (2016).
  33. Li, J., Baccei, M. L. Developmental regulation of membrane excitability in rat spinal lamina I projection neurons. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2604-2614 (2012).
  34. Li, J., Baccei, M. L. Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).
  35. Sandkühler, J., Eblen-Zajjur, A. Identification and characterization of rhythmic nociceptive and non-nociceptive spinal dorsal horn neurons in the rat. Neurosciences. 61 (4), 991-1006 (1994).
  36. Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons. Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).
  37. Antonio, L., et al. L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).
  38. Avoli, M., Jefferys, J. G. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
  39. Taccola, G., Nistri, A. Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro. Neurosciences. 126 (2), 511-520 (2004).
  40. Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).
  41. Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices. Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).

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Iredale, J. A., Stoddard, J. G., Drury, H. R., Browne, T. J., Elton, A., Madden, J. F., Callister, R. J., Welsh, J. S., Graham, B. A. Recording Network Activity in Spinal Nociceptive Circuits Using Microelectrode Arrays. J. Vis. Exp. (180), e62920, doi:10.3791/62920 (2022).
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