التصوير أحادي الجزيء لتجميع مكثفات EWS-FLI1 على الحمض النووي
Summary
هنا ، نصف استخدام طريقة التصوير أحادية الجزيء ، ستائر الحمض النووي ، لدراسة الآلية الفيزيائية الحيوية لمكثفات EWS-FLI1 المتجمعة على الحمض النووي.
Abstract
تم العثور على جينات الاندماج الناتجة عن نقل الكروموسومات في العديد من الأورام الصلبة أو سرطان الدم. EWS-FLI1 ، الذي ينتمي إلى عائلة FUS / EWS / TAF15 (FET) من البروتينات السرطانية الاندماجية ، هو أحد جينات الاندماج الأكثر مشاركة في ساركوما إيوينغ. عادة ما تحتوي بروتينات اندماج عائلة FET هذه على مجال منخفض التعقيد (LCD) من بروتين FET في نهايتها N ومجال ربط الحمض النووي (DBD) في نهايتها C. تم التأكيد على أن EWS-FLI1 يشكل مكثفات جزيئية حيوية في مواضع الربط المستهدفة بسبب تفاعلات LCD-LCD و LCD-DBD ، ويمكن لهذه المكثفات تجنيد بوليميراز RNA II لتعزيز النسخ الجيني. ومع ذلك ، فإن كيفية تجميع هذه المكثفات في مواقع الربط الخاصة بها لا تزال غير واضحة. في الآونة الأخيرة ، تم تطبيق طريقة الفيزياء الحيوية أحادية الجزيء – ستائر الحمض النووي – لتصور عمليات التجميع هذه لمكثفات EWS-FLI1. هنا ، تتم مناقشة البروتوكول التجريبي التفصيلي ونهج تحليل البيانات لتطبيق ستائر الحمض النووي في دراسة المكثفات الجزيئية الحيوية التي تتجمع على الحمض النووي المستهدف.
Introduction
يعد تنظيم النسخ خطوة حاسمة للتعبير الجيني الدقيق في الخلايا الحية. تشارك العديد من العوامل ، مثل تعديل الكروموسومات وعوامل النسخ (TFs) والحمض النووي الريبي غير المشفر ، في هذه العملية المعقدة1،2،3. من بين هذه العوامل ، تساهم TFs في خصوصية تنظيم النسخ من خلال التعرف على تسلسلات الحمض النووي المحددة المعروفة باسم المروجين أو المعززات وربطها ، وبالتالي تجنيد بروتينات وظيفية أخرى لتنشيط أو قمع النسخ4،5،6،7. كيف تمكنت فرق العمل هذه من البحث عن مواقعها المستهدفة في الجينوم البشري والتفاعل مع الحمض النووي المغلف بالهستونات والبروتينات غير المرتبطة بالحمض النووي قد حيرت العلماء لعقود. في السنوات القليلة الماضية ، تم بناء العديد من النماذج الكلاسيكية لآلية البحث المستهدفة ل TFs لوصف كيفية “الانزلاق” أو “القفز” أو “القفز” أو “النقل بين القطاعات” على طول سلسلة الحمض النووي8،9،10،11. تركز هذه النماذج على سلوك البحث عن الحمض النووي لجزيء TF واحد. ومع ذلك ، تظهر الدراسات الحديثة أن بعض TFs تخضع لفصل الطور السائل والسائل (LLPS) إما بمفردها في النواة أو مع مجمع الوسيط12. ترتبط القطرات المرصودة ل TFs بمناطق المروج أو المحسن ، مما يسلط الضوء على دور تكوين المكثفات الجزيئية الحيوية في النسخ والجينوم ثلاثي الأبعاد13،14،15. ترتبط هذه المكثفات الجزيئية الحيوية بمقصورات تفتقر إلى الغشاء في الجسم الحي وفي المختبر. يتم تشكيلها عبر LLPS ، حيث تكون الجزيئات الحيوية المعيارية والمناطق المضطربة جوهريا (IDRs) للبروتينات قوتين دافعتين رئيسيتين للتفاعلات متعددة التكافؤ16. وبالتالي ، لا تبحث TFs عن الحمض النووي فحسب ، بل تعمل أيضا بشكل تآزري داخل هذه المكثفات4،17،18. حتى الآن ، لا تزال الخاصية الفيزيائية الحيوية لمكثفات النسخ هذه على الحمض النووي غير واضحة.
لذلك ، هدفت هذه الدراسة إلى تطبيق طريقة أحادية الجزيء – ستائر الحمض النووي – لتصوير تكوين وديناميكيات مكثفات النسخ التي شكلتها TFs على الحمض النووي في المختبر مباشرة. تم تطبيق ستائر الحمض النووي ، وهي منصة تصوير عالية الإنتاجية في المختبر لدراسة التفاعل بين البروتينات والحمض النووي ، في إصلاح الحمض النووي19،20،21 ، والبحث المستهدف 22 ، و LLPS17،23،24. يتم طلاء خلية التدفق من ستائر الحمض النووي بطبقات ثنائية دهنية بيوتينيل لتخميل السطح والسماح للجزيئات الحيوية بالانتشار على السطح. تحد الأنماط المتعرجة النانوية من حركة الحمض النووي. يمكن محاذاة ركائز الحمض النووي Lambda Biotinylated على طول حواف الحاجز وتمتد بواسطة التدفق العازل الموجه. تسمح نفس تسلسلات البداية والنهاية لجميع الجزيئات بتتبع البروتين على الحمض النووي ووصف توزيع موضع أحداث الربط25,26. علاوة على ذلك ، فإن الجمع بين ستائر الحمض النووي والفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRFM) يساعد على تقليل ضوضاء الخلفية واكتشاف الإشارات على مستوى جزيء واحد. وبالتالي ، يمكن أن تكون ستائر الحمض النووي طريقة واعدة للتحقيق في ديناميكيات تكوين مكثفات النسخ على أشكال الحمض النووي. تصف هذه الورقة مثال على بروتين ورمي اندماجي لعائلة FUS / EWS / TAF15 (FET) ، EWS-FLI1 ، الناتج عن إزفاء الكروموسومات. تم استخدام Lambda DNA الذي يحتوي على 25× GGAA – تسلسل الربط ل EWS-FLI127 – كركيزة للحمض النووي في تجارب ستائر الحمض النووي لمراقبة كيفية خضوع جزيئات EWS-FLI1 ل LLPS على الحمض النووي. تناقش هذه المخطوطة البروتوكول التجريبي وطرق تحليل البيانات بالتفصيل.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظرا لأن نهج الجزيء الواحد حساس للغاية لمحتويات نظام التفاعل ، يجب بذل جهد إضافي لضمان جودة جيدة لجميع المواد والمحاليل أثناء تجارب ستائر الحمض النووي ، وخاصة الدهون المحضرة في القسمين 1 و 2 والمخازن المؤقتة المستخدمة في القسم 5. يجب استخدام الكواشف ذات النقاء العالي لإعداد المخازن المؤقت?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل منح NSFC رقم 31670762 (Z.Q.).
Materials
| 488 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS488LS | |
| 561 nm diodepumped solid-state laser | Coherent | OBIS561LS | |
| Agar | Rhawn | R003215-50g | |
| biotinylated DOPE | Avanti | 870273P | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Amresco | 1595C027 | |
| Coating Electra 92 | Allresist GmbH | AR-PC 5090.02 | The conductive protective coating |
| Deoxyribonuclease I bovine | Sigma | D5139-2MG | |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939-1EA | |
| KCl | Sigma | 60130 | |
| Lambda DNA | NEB | N3013S | |
| Lambda Packing Extracts | Epicentre | MP5120 | |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | |
| NaCl | Sigma | s3014 | |
| Nanoport | Idex | N-333-01 | |
| NheI-HF | NEB | R3131S | |
| Nikon Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| NZCYM Broth | Sigma | N3643-250G | |
| PEG-2000 DOPE | Avanti | 880130P-1G | |
| PEG-8000 | Amresco | 25322-68-3 | |
| PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4% | Allresist GmbH | AR-P 649.04 | |
| PMMA 950K, ANISOLE 2% | Allresist GmbH | AR-P 672.02 | |
| Prime 95B Scientific CMOS camera | PHOTOMETRICS | Prime95B | |
| proteinase K | NEB | P8107S | |
| Silica glass slide | G.Finkenbeiner | ||
| Six-way injection valve | Idex | MXP9900-000 | |
| Streptavidin | Thermo | S888 | Diluted with ddH2O |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump11 Elite | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| XhoI | NEB | R0146V | |
| YOYO-1 Iodide (491/509) | Invitrogen | Y3601 | Diluted with DMSO |
References
- Cramer, P. Organization and regulation of gene transcription. Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).
- Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).
- Wang, X., et al. Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription. Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).
- Alexander, K. A., et al. p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression. Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).
- Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II. Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).
- Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions. Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).
- Peng, Y., Zhang, Y. Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).
- Lambert, S. A., et al. The human transcription factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
- Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).
- Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. Biochimie. 20 (24), 6929-6948 (1981).
- Loverdo, C., et al. Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins. Physical Review Letters. 102 (18), 188101 (2009).
- Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
- Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), (2018).
- Kim, S., Shendure, J. Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome. Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).
- Shrinivas, K., et al. Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates. Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).
- Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
- Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
- Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers. Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Qi, Z., Greene, E. C. Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains. Methods. 105, 62-74 (2016).
- Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament. Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
- Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547, 236-240 (2017).
- Zuo, L., et al. Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription. Nature Communications. 12 (1), 1491 (2021).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
- Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing’s sarcoma. Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).
- Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours. Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
- Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).
- Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R., Selvin, P. R., Ha, T. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , (2008).
- Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001 (2017).
