Summary

Sitokin Diferansiye İnsan Primer T Hücrelerinde Mitokondriyal Solunumun Gerçek Zamanlı İzlenmesi

Published: October 19, 2021
doi:

Summary

Metabolik adaptasyon, farklılaşmayı, kalıcılığı ve sitotoksisiteyi belirlediği için T hücreleri için temeldir. Burada, ex vivo sitokin farklılaşmış insan primer T hücrelerinde mitokondriyal solunumu izlemek için optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.

Abstract

Aktivasyon sırasında, T hücrelerinin metabolizması, kaderlerini etkileyen değişikliklere adapte olur. Mitokondriyal oksidatif fosforilasyondaki artış, T hücresi aktivasyonu için vazgeçilmezdir ve hafıza T hücrelerinin hayatta kalması mitokondriyal yeniden şekillenmeye bağlıdır. Sonuç olarak, bu kanser immünoterapilerinin uzun vadeli klinik sonuçlarını etkiler. T hücre kalitesindeki değişiklikler genellikle doğrudan metabolik durumlarıyla değil, iyi bilinen yüzey belirteçleri kullanılarak akış sitometrisi ile incelenir. Bu, bir Hücre Dışı Akı Analizörü ve T hücresi metabolizmasını farklı şekilde etkileyen sitokinler IL-2 ve IL-15 kullanarak birincil insan T hücrelerinin gerçek zamanlı mitokondriyal solunumunu ölçmek için optimize edilmiş bir protokoldür. T hücrelerinin metabolik durumunun, metabolik yolaktaki anahtar kompleksleri inhibe ederken oksijen tüketiminin ölçülmesiyle açıkça ayırt edilebileceği ve bu ölçümlerin doğruluğunun optimal inhibitör konsantrasyonuna ve inhibitör enjeksiyon stratejisine büyük ölçüde bağlı olduğu gösterilmiştir. Bu standartlaştırılmış protokol, mitokondriyal solunumun kanser immünoterapilerinin izlenmesinde ve incelenmesinde T hücresi uygunluğu için bir standart olarak uygulanmasına yardımcı olacaktır.

Introduction

Doğru T hücresi gelişimi ve fonksiyonu, bağışıklık sisteminin antijenleri tanıma ve bunlara yanıt verme yeteneği için gereklidir. Mitokondriyal oksidatif fosforilasyon (OxPhos), T hücresinin durumuna göre değişir. Naif T hücreleri ağırlıklı olarak ATP üretmek için OxPhos kullanırken, aktive olmuş T hücreleri glikolizin baskın hale geldiği metabolik bir geçişe uğrar1. Efektör fazından sonra, bellek T hücrelerinin kalan küçük alt kümesi, OxPhos2,3’ün hakim olduğu metabolik bir duruma geri döner. OxPhos’un değişiklikleri, T hücrelerinin farklılaşmasını öyle bir dereceye kadar takip eder ki, T hücrelerinin alt kümeleri bile spesifik OxPhos özellikleri ile ayırt edilebilir1. Tersine, OxPhos, T hücrelerinin işlevi için önemlidir ve OxPhos’un inhibisyonunun, T hücrelerinin proliferasyonunu ve sitokin üretimini bloke ettiği gösterilmiştir4. Bu nedenle, T hücresi OxPhos’un özelliklerini kesin ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçme yeteneği, T hücreleri ile çalışan herkes için güçlü bir araçtır.

Bu protokolde, T hücresi OxPhos’un özellikleri, hücre dışı bir akı analizörü kullanılarak ölçülür. Bu analizörün temel işlevi, analiz edilecek hücrelerin büyüme ortamının oksijen içeriğini sürekli olarak ölçmektir. Büyüme ortamından çıkarılan oksijenin hücreler tarafından alındığı varsayılır. Hücreleri çeşitli OxPhos inhibitörleri veya modifiye edicileri ile tedavi ederek, oksijen alımındaki bir düşüş, inhibe edilmiş veya modüle edilmiş fonksiyon ile ilişkilidir. Örneğin, ATP sentazının inhibisyonu, aksi takdirde oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretmek için kullanılacak olan hücresel oksijen alımının azalmasına yol açacaktır. Clark elektrodu ve Oroboros enstrümanı da dahil olmak üzere diğer ekipmanlar benzer işlevsellik sunar ve her enstrümanın farklı avantajları ve eksiklikleri vardır. Bu cihazlardaki çalışmalar için çok çeşitli hücre tipleri kullanılabilir, ancak özellikle zorlu bir hücre tipi insan primer T lenfositleridir5. Küçük boyutları, zayıf sağkalım ex vivo ve yapışkan olmayan özellikleri nedeniyle, insan birincil T hücrelerinin incelenmesi zor olabilir.

Bu, insan birincil T hücrelerinin mitokondriyal solunumunu hücre dışı bir analizör tarafından incelemek için bir protokoldür. Protokol, kuyu başına optimal hücre sayısı konsantrasyonlarının yanı sıra optimal oligomisin ve FCCP konsantrasyonunun belirlendiği bir Optimizasyon çalışmasına bölünmüştür. Ayrıca, optimize edilmiş koşulların kullanıldığı bir Tahlil çalışması.

Kan kaynaklı insan PBMC’lerini ve ex vivo primer T hücre kültürlerini kullanan bu protokol, optimal inhibitör konsantrasyonunun önemini ve hassas hücre tipleriyle çalışırken mitokondriyal inhibitörlerin sıralı enjeksiyonu yerine ayrı ayrı kullanılmasının önemini göstermektedir. Son olarak, bu tahlilin IL-2 ve IL-15 sitokinleri ile polarizasyon üzerine mitokondriyal solunumdaki ince farklılıkları sağlam bir şekilde tespit edebileceği gösterilmiştir.

Protocol

Deneyler, Herlev Hastanesi ve Danimarka’nın Başkent Bölgesi’nin yönergeleri altında gerçekleştirildi. NOT: Bu protokol hem Optimizasyon çalıştırması hem de Tahliller çalıştırması için yönergeler içerir. Talimatlar bir Optimizasyon çalıştırması veya bir Tahlil çalıştırması için olduğunda metinde açıkça yazılır. Tahlil çalıştırmalarına devam etmeden önce bir Optimizasyon çalıştırması çalıştırın 1. Buffy paltol…

Representative Results

OxPhos özelliklerinin doğru belirlenmesi, T hücrelerini incelerken vazgeçilmez bir araçtır. Bununla birlikte, tahlil koşulları optimize edilmemişse, yanıltıcı veya hatalı sonuçlar elde etme riski vardır. Bu protokolde, kuyu başına hücre sayısının optimizasyonuna ve kullanılacak oligomisin ve FCCP konsantrasyonlarına güçlü bir odaklanma vardır. Tarif edilen kurulumda, oligomisin ve FCCP aynı kuyuya kademeli olarak eklenir ve mitokondriyal modülatörlerin konsantrasyonu arttırılır. Oligomisi…

Discussion

Oksidatif fosforilasyonun ayrıntılı ve doğru bir şekilde ölçülmesi, T hücrelerinin enerji durumlarını tanımlarken vazgeçilmez bir araçtır. Mitokondriyal uygunluk durumu, T hücresi aktivasyon potansiyeli, sağkalım ve farklılaşma ile doğrudan ilişkili olabilir1,5. Bu protokolle, oksidatif fosforilasyonun çeşitli özelliklerini belirlemek mümkündür (ayrıntılı bir açıklama için Tablo 4’e bakınız). Oksidatif fosforil…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Kasper Mølgaard ve Anne Rahbech, Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat’tan hibe aldı. Kasper Mølgaardayrıca Børnecancerfonden’den hibe aldı.

Materials

24-well tissue culture plate Nunc 142485
Anti-CD3xCD28 beads Gibco 11161D
Antimycin A Merck A8674
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cell-Tak Corning 354240 For coating
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D9170
Human Serum Sigma Aldrich H4522 Heat inactivated at 56 °C for 30 min
IL-15 Peprotech 200-02
IL-2 Peprotech 200-15
Lymphoprep Stemcell Technologies 07801
Oligomycin Merck O4876
PBS Thermo Fisher 10010023
RPMI 1640 Gibco-Thermo Fisher 61870036
Seahorse Calibrant Agilent Technologies 102416-100
Seahorse XF 1.0 M glucose solution Agilent Technologies 103577-100
Seahorse XF 100 mM pytuvate solution Agilent Technologies 103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine solution Agilent Technologies 103579-100
Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 Agilent Technologies 103576-100 XF RPMI media
Seahorse XFe96 Analyser Agilent Technologies Flux analyzer
Seahorse XFe96 cell culture microplates Agilent Technologies 102416-100 XF cell culture plate
Seahorse XFe96 sensor cartridge Agilent Technologies 102416-100
Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) Sigma Aldrich 36486
Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) Sigma Aldrich S2770-100ML
X-VIVO 15 Lonza BE02-060F
T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher 12321D
Seahorse wave Flux analyzer software

References

  1. vander Windt, G. J. W., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
  2. Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. Signaling takes a breath–new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction. Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).
  3. vander Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).
  4. Chang, C. -. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
  5. vander Windt, G. J. W., Chang, C. -. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).
  6. Buck, M. D., O’Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
  7. Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).
  8. Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
  9. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
  10. Alizadeh, D., et al. IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype. Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).

Play Video

Citer Cet Article
Mølgaard, K., Rahbech, A., Met, Ö., Svane, I. M., thor Straten, P., Desler, C., Peeters, M. J. W. Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells. J. Vis. Exp. (176), e62984, doi:10.3791/62984 (2021).

View Video