يوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام مضيف النبات للكشف عن البروتينات اللعابية لنطاط الأوراق والبروتينات الفيروسية النباتية التي تطلقها ناقلات نطاط الأوراق.
تنقل ناقلات الحشرات أفقيا العديد من الفيروسات النباتية ذات الأهمية الزراعية. ينتقل أكثر من نصف فيروسات النبات عن طريق الحشرات النصفية التي لها أجزاء فم خارقة مصة. أثناء انتقال الفيروس ، يربط لعاب الحشرات مضيف الفيروس الناقل لأن اللعاب ينقل الفيروسات ، وبروتينات الحشرات ، تحفز أو تثبط الاستجابة المناعية للنباتات من الحشرات إلى مضيفات النباتات. أصبح تحديد البروتينات اللعابية وتحليلها وظيفيا مجالا جديدا للتركيز في مجال البحث في تفاعلات الفيروسات المنقولة بالمفصليات مع المضيف. يوفر هذا البروتوكول نظاما للكشف عن البروتينات في لعاب نطاطات الأوراق باستخدام مضيف النبات. ومن الأمثلة على ذلك ناقل نطاط الأوراق Nephotettix cincticeps المصاب بفيروس قزم الأرز (RDV). يمكن الكشف عن vitellogenin وبروتين القفيصة الخارجي الرئيسي P8 من RDV المتجه بواسطة لعاب N. cincticeps في وقت واحد في نبات الأرز الذي يتغذى عليه N. cincticeps. هذه الطريقة قابلة للتطبيق لاختبار البروتينات اللعابية التي يتم الاحتفاظ بها بشكل عابر في مضيف النبات بعد تغذية الحشرات. ويعتقد أن نظام الكشف هذا سيفيد دراسة تفاعلات فيروس نصف الدم أو النبات النصفي.
إن طريقة انتقال الفيروسات المنقولة بالمفصليات ذات النواقل والمضيف ، وهي مشكلة أساسية ، هي في حدود العلوم البيولوجية. تنتقل العديد من الفيروسات النباتية ذات الأهمية الزراعية أفقيا عن طريق ناقلات الحشرات1. يتم نقل أكثر من نصف فيروسات النبات بواسطة الحشرات النصفية ، بما في ذلك حشرات المن ، والذباب الأبيض ، ونطاطات الأوراق ، ونطاطات النبات ، والتريبس. هذه الحشرات لها سمات مميزة تمكنها من نقل فيروسات النبات بكفاءة1. لديهم أجزاء فم مص خارقة ويتغذون على النسغ من اللحاء ونسيج الخشب ، ويفرزون لعابهم1،2،3،4. مع تطوير وتحسين التقنيات ، أصبح تحديد المكونات اللعابية وتحليلها وظيفيا محورا جديدا للبحث المكثف. تشمل البروتينات اللعابية المعروفة في اللعاب العديد من الإنزيمات ، مثل البكتينستيراز ، السليولاز ، البيروكسيديز ، الفوسفاتيز القلوي ، أوكسيديز البوليفينول ، والسكراز ، من بين أمور أخرى5،6،7،8،9،10،11،12،13. تشتمل البروتينات الموجودة في اللعاب أيضا على المحفزات التي تؤدي إلى استجابة دفاع المضيف ، وبالتالي تغيير أداء الحشرات ، والمستجيبات التي تثبط دفاع المضيف ، مما يعزز لياقة الحشرات والمكونات التي تحفز الاستجابات المرضية للمضيف14،15،16،17. لذلك ، تعتبر بروتينات اللعاب مواد حيوية للتواصل بين الحشرات والمضيفين. أثناء انتقال الفيروسات ، يحتوي اللعاب الذي تفرزه الغدد اللعابية للحشرات الخبيثة الماصة للثقب أيضا على بروتينات فيروسية. تستخدم المكونات الفيروسية تدفق اللعاب لإطلاقها من الحشرة إلى مضيف النبات. لذلك ، فإن لعاب الحشرات يسد التفاعل الثلاثي التغذية بين الفيروس والناقل والمضيف. يساعد التحقيق في الوظيفة البيولوجية لبروتينات اللعاب التي تفرزها الحشرات الخبيثة على فهم العلاقة بين الفيروس والناقل والمضيف.
بالنسبة للفيروسات الحيوانية ، أفيد أن لعاب البعوض يتوسط في انتقال وإمراض فيروس غرب النيل (WNV) وفيروس حمى الضنك (DENV). يعزز بروتين اللعاب AaSG34 تكاثر فيروس حمى الضنك -2 وانتقاله ، بينما يعزز بروتين اللعاب AaVA-1 انتقال فيروس حمى الضنك وفيروس زيكا (ZIKV) عن طريق تنشيط الالتهام الذاتي18,19. يمكن لبروتين اللعاب D7 من البعوض أن يثبط عدوى فيروس حمى الضنك في المختبر وفي الجسم الحي عن طريق التفاعل المباشر مع فيروسات DENV وبروتين غلاف DENVالمؤتلف 20. في الفيروسات النباتية ، يحفز فيروس تجعد الأوراق الصفراء للطماطم (TYLCV) بروتين لعابية الذبابة البيضاء Bsp9 ، الذي يثبط مناعة مضيف النبات بوساطة WRKY33 ، لزيادة تفضيل وأداء الذباب الأبيض ، مما يؤدي في النهاية إلى زيادة انتقال الفيروسات21. نظرا لأن الدراسات حول الدور الذي تلعبه البروتينات اللعابية الحشرية في المضيفين النباتيين قد تخلفت عن دراسات المضيفين من الحيوانات ، فإن هناك حاجة ماسة إلى نظام مستقر وموثوق للكشف عن البروتينات اللعابية في المضيفين النباتيين.
ينتقل فيروس النبات المعروف باسم فيروس قزم الأرز (RDV) بواسطة نطاط الأوراق Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) بكفاءة عالية وبطريقة إكثارية مستمرة22,23. تم الإبلاغ لأول مرة عن انتقال RDV عن طريق ناقل الحشرات ويسبب مرضا شديدا للأرز في آسيا24,25. الفيريون هو كروي ثنائي السطوح ومزدوج الطبقات ، وتحتوي الطبقة الخارجية على بروتين القفيصة الخارجي P822. فترة انتقال الدورة الدموية ل RDV في N. cincticeps هي 14 يوما26،27،28،29،30. عندما يصل RDV إلى الغدد اللعابية ، يتم إطلاق الفيروسات في تجاويف مخزنة في اللعاب في الغدد اللعابية عبر آلية تشبه الإخراجالخلوي 23. فيتلوجينين (Vg) هو سلائف بروتين الصفار الضرورية لتطور البويضات في الحشراتالأنثوية 31،32،33. تحتوي معظم أنواع الحشرات على نسخة Vg واحدة على الأقل من 6-7 كيلو بايت ، والتي تشفر بروتين سلائف يبلغ حوالي 220 كيلو دالتون. يمكن عادة شق سلائف البروتين في Vg إلى شظايا كبيرة (140 إلى 190 كيلو دالتون) وشظايا صغيرة (<50 كيلو دالتون) قبل دخول المبيض18,19. كشف التحليل البروتيني السابق عن وجود الببتيدات المشتقة من Vg في اللعاب المفرز لنطاط الأوراق Recilia dorsalis ، على الرغم من أن وظيفتها غير معروفة (بيانات غير منشورة). تم الإبلاغ حديثا عن أن Vg ، الذي يفرز عن طريق الفم من نطاطات النبات ، يعمل كمستجيب لإتلاف دفاعات النباتات34. من غير المعروف ما إذا كان يمكن أيضا إطلاق Vg of N. cincticeps إلى مضيف النبات مع تدفق اللعاب ، ومن ثم يمكن أن يلعب دورا في النبات للتداخل مع دفاعات النبات. لمعالجة ما إذا كانت N. cincticeps تستغل البروتينات اللعابية ، مثل Vg ، لتثبيط أو تنشيط دفاعات النبات ، فإن الخطوة الأولى هي تحديد البروتينات التي يتم إطلاقها للنبات أثناء التغذية. من المحتمل أن يكون فهم طريقة تحديد البروتينات اللعابية الموجودة في النبات ضروريا لشرح وظيفة بروتينات اللعاب والتفاعلات بين Hemiptera والنباتات.
في البروتوكول المقدم هنا ، يتم استخدام N. cincticeps كمثال لتوفير طريقة لفحص وجود البروتينات اللعابية في مضيف النبات الذي يتم إدخاله من خلال تغذية الحشرات. يفصل البروتوكول في المقام الأول جمع واكتشاف البروتينات اللعابية وهو مفيد لمزيد من التحقيق في معظم hemipterans.
يلعب اللعاب الذي تفرزه الغدد اللعابية مباشرة للحشرات الماصة للثقب دورا محوريا لأنه يهضم ويزيل السموم من الأنسجة المضيفة والعوامل البيولوجية عبر المملكة في المضيفين1،3،4. العوامل البيولوجية عبر المملكة ، بما في ذلك المستنبطات والمستجيبا…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31772124 و 31972239) وجامعة فوجيان للزراعة والغابات (Grant KSYLX014).
Reagents | |||
Tris base | Roche | D609K69032 | For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10×TBS buffer preparation |
KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10×TBS buffer preparation |
ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4× protein sample buffer preparation |
bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4× protein sample buffer preparation |
glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4× protein sample buffer preparation |
methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
Buffers and Solutions | |||
Buffer | Composition | Comments/Description | |
5×Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris base 94 g glycine 5 g SDS in 1 L sterile water |
Stock solution | |
1×Tris-glycine buffer | 200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water |
Work solution, for SDS-PAGE | |
10×Tris-buffered saline (TBS) buffer | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water |
Stock solution | |
TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water |
Work solution | |
4× protein sample buffer | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
For protein extraction | |
Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol |
For protein transfer | |
Instruments | |||
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4x protein sample buffer preparation |
Constant temperature incubator | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | For rearing leafhoppers |
Electrophoresis | Tanon Science & Technology Co.,Ltd. | Tanon EP300 | For SDS-PAGE |
Electrophoretic transfer core module | BIO-RAD | 1703935 | For SDS-PAGE |
glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4x protein sample buffer preparation |
glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
High-pass tissue grinding instrument | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | For grinding plant tissues |
KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10x TBS buffer preparation |
methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
Mini wet heat transfer trough | BIO-RAD | 1703930 | For SDS-PAGE |
NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10x TBS buffer preparation |
nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
Protein color instrument | GE Healthcare bio-sciences AB | Amersham lmager 600 | For detecting proteins |
SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
Tris base | Roche | D609K69032 | For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
Vertical plate electrophoresis tank | BIO-RAD | 1658001 | For SDS-PAGE |
Water bath | Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | For boil the protein samples |
β-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4x protein sample buffer preparation |