Questo protocollo dimostra come utilizzare l’ospite della pianta per rilevare le proteine salivari delle cicaline e le proteine virali vegetali rilasciate dai vettori delle cicaline.
Gli insetti vettori trasmettono orizzontalmente molti virus vegetali di importanza agricola. Più della metà dei virus vegetali sono trasmessi da insetti emitteri che hanno apparato boccale penetrante-succhiatore. Durante la trasmissione virale, la saliva dell’insetto collega il virus-vettore-ospite perché i virus vettori della saliva e le proteine degli insetti innescano o sopprimono la risposta immunitaria delle piante dagli insetti agli ospiti delle piante. L’identificazione e l’analisi funzionale delle proteine salivari stanno diventando una nuova area di interesse nel campo di ricerca delle interazioni arbovirus-ospite. Questo protocollo fornisce un sistema per rilevare le proteine nella saliva delle cicaline utilizzando l’ospite della pianta. Il vettore cicalina Nephotettix cincticeps infettato dal virus nano del riso (RDV) serve come esempio. La vitellogenina e la principale proteina del capside esterno P8 di RDV veicolata dalla saliva di N. cincticeps possono essere rilevate simultaneamente nella pianta di riso di cui si nutre N. cincticeps. Questo metodo è applicabile per testare le proteine salivari che vengono trattenute transitoriamente nell’ospite della pianta dopo l’alimentazione degli insetti. Si ritiene che questo sistema di rilevamento andrà a beneficio dello studio delle interazioni emittero-virus-pianta o emittero-pianta.
La modalità di trasmissione vettore-ospite degli arbovirus, un problema fondamentale, è alla frontiera della scienza biologica. Molti virus vegetali di importanza agricola sono trasmessi orizzontalmente da insetti vettori1. Più della metà dei virus vegetali sono veicolati da insetti emitteri, tra cui afidi, mosche bianche, cicaline, cicaline e tripidi. Questi insetti hanno caratteristiche distinte che consentono loro di trasmettere in modo efficiente i virus delle piante1. Possiedono apparato boccale penetrante-succhiante e si nutrono della linfa di floema e xilema e secernono la loro saliva 1,2,3,4. Con lo sviluppo e il miglioramento delle tecniche, l’identificazione e l’analisi funzionale delle componenti salivari stanno diventando un nuovo obiettivo di ricerca intensiva. Le proteine salivari conosciute nella saliva includono numerosi enzimi, come la pectinesterasi, la cellulasi, la perossidasi, la fosfatasi alcalina, la polifenolo ossidasi e la sucrasi, tra gli altri 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Le proteine della saliva includono anche elicitori che innescano la risposta di difesa dell’ospite, alterando così le prestazioni degli insetti, ed effettori che sopprimono la difesa dell’ospite, che migliora la forma fisica degli insetti e componenti che inducono risposte patologiche dell’ospite14,15,16,17. Pertanto, le proteine della saliva sono materiali vitali per la comunicazione tra insetti e ospiti. Durante la trasmissione dei virus, la saliva secreta dalle ghiandole salivari degli insetti viruliferi penetranti contiene anche proteine virali. I componenti virali utilizzano il flusso di saliva per rilasciarli dall’insetto all’ospite della pianta. Pertanto, la saliva dell’insetto collega l’interazione tritrofica virus-vettore-ospite. Studiare la funzione biologica delle proteine della saliva secrete dagli insetti viruliferi aiuta a comprendere la relazione virus-vettore-ospite.
Per i virus animali, è stato riferito che la saliva delle zanzare media la trasmissione e la patogenicità del virus del Nilo occidentale (WNV) e del virus Dengue (DENV). La proteina saliva AaSG34 promuove la replicazione e la trasmissione del virus dengue-2, mentre la proteina saliva AaVA-1 promuove la trasmissione dei virus DENV e Zika (ZIKV) attivando l’autofagia18,19. La proteina saliva D7 delle zanzare può inibire l’infezione da DENV in vitro e in vivo attraverso l’interazione diretta con i virioni DENV e la proteina ricombinante dell’involucro DENV20. Nei virus vegetali, il begomovirus tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) induce la proteina salivare Bsp9 della mosca bianca, che sopprime l’immunità mediata da WRKY33 dell’ospite della pianta, per aumentare la preferenza e le prestazioni delle mosche bianche, aumentando infine la trasmissione dei virus21. Poiché gli studi sul ruolo che le proteine salivari degli insetti svolgono negli ospiti delle piante sono rimasti indietro rispetto a quelli degli ospiti animali, è urgentemente necessario un sistema stabile e affidabile per rilevare le proteine salivari negli ospiti delle piante.
Il virus vegetale noto come virus nano del riso (RDV) è trasmesso dalla cicalina Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) con elevata efficienza e in modo persistentemente propagante22,23. RDV è stato segnalato per la prima volta per essere trasmesso da un insetto vettore e causa una grave malattia del riso in Asia24,25. Il virione è icosaedrico e sferico a doppio strato, e lo strato esterno contiene la proteina22 del capside esterno P8. Il periodo di trasmissione circolativa di RDV in N. cincticeps è di 14 giorni 26,27,28,29,30. Quando l’RDV arriva alle ghiandole salivari, i virioni vengono rilasciati nelle cavità immagazzinate nella saliva nelle ghiandole salivari attraverso un meccanismo simile all’esocitosi23. La vitellogenina (Vg) è il precursore della proteina del tuorlo essenziale per lo sviluppo degli ovociti nelle femmine di insetti31,32,33. La maggior parte delle specie di insetti ha almeno un trascritto Vg di 6-7 kb, che codifica per una proteina precursore di circa 220 kDa. I precursori proteici di Vg possono solitamente essere scissi in frammenti grandi (da 140 a 190 kDa) e piccoli (<50 kDa) prima di entrare nell'ovaio18,19. Precedenti analisi proteomiche hanno rivelato la presenza dei peptidi derivati da Vg nella saliva secreta della cicalina Recilia dorsalis, sebbene la loro funzione sia sconosciuta (dati non pubblicati). È stato recentemente riportato che Vg, che è secreto per via orale dalle cavallette, funziona come effettore per danneggiare le difese delle piante34. Non è noto se il Vg di N. cincticeps possa anche essere rilasciato all’ospite della pianta con flusso salivare, e quindi potrebbe svolgere un ruolo nella pianta per interferire con le difese della pianta. Per capire se N. cincticeps sfrutta le proteine salivari, come Vg, per inibire o attivare le difese delle piante, il primo passo è identificare le proteine rilasciate alla pianta durante l’alimentazione. Comprendere il metodo per identificare le proteine salivari presenti nella pianta è potenzialmente essenziale per spiegare la funzione delle proteine della saliva e le interazioni tra Hemiptera e piante.
Nel protocollo qui presentato, N. cincticeps è usato come esempio per fornire un metodo per esaminare la presenza di proteine salivari nell’ospite della pianta introdotte attraverso l’alimentazione degli insetti. Il protocollo descrive principalmente la raccolta e la rilevazione delle proteine salivari ed è utile per ulteriori indagini sulla maggior parte degli emitteri.
La saliva direttamente secreta dalle ghiandole salivari degli insetti penetranti svolge un ruolo fondamentale perché predigerisce e disintossica i tessuti ospiti e i fattori biologici cross-kingdom dei vettori negli ospiti 1,3,4. I fattori biologici cross-kingdom, inclusi elicitori, effettori e piccolo RNA, sono critici per la comunicazione insetto-ospite14,15,16</…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31772124 e 31972239) e della Fujian Agriculture and Forestry University (Grant KSYLX014).
Reagents | |||
Tris base | Roche | D609K69032 | For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10×TBS buffer preparation |
KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10×TBS buffer preparation |
ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4× protein sample buffer preparation |
bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4× protein sample buffer preparation |
glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4× protein sample buffer preparation |
methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
Buffers and Solutions | |||
Buffer | Composition | Comments/Description | |
5×Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris base 94 g glycine 5 g SDS in 1 L sterile water |
Stock solution | |
1×Tris-glycine buffer | 200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water |
Work solution, for SDS-PAGE | |
10×Tris-buffered saline (TBS) buffer | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water |
Stock solution | |
TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water |
Work solution | |
4× protein sample buffer | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
For protein extraction | |
Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol |
For protein transfer | |
Instruments | |||
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4x protein sample buffer preparation |
Constant temperature incubator | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | For rearing leafhoppers |
Electrophoresis | Tanon Science & Technology Co.,Ltd. | Tanon EP300 | For SDS-PAGE |
Electrophoretic transfer core module | BIO-RAD | 1703935 | For SDS-PAGE |
glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4x protein sample buffer preparation |
glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
High-pass tissue grinding instrument | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | For grinding plant tissues |
KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10x TBS buffer preparation |
methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
Mini wet heat transfer trough | BIO-RAD | 1703930 | For SDS-PAGE |
NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10x TBS buffer preparation |
nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
Protein color instrument | GE Healthcare bio-sciences AB | Amersham lmager 600 | For detecting proteins |
SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
Tris base | Roche | D609K69032 | For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
Vertical plate electrophoresis tank | BIO-RAD | 1658001 | For SDS-PAGE |
Water bath | Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | For boil the protein samples |
β-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4x protein sample buffer preparation |