Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Spektrofotometriska metoder för studier av eukaryot glykogenmetabolism

Published: August 19, 2021 doi: 10.3791/63046
Automatic Translation
1
1Department of Biochemistry & Nutrition, Des Moines University

Summary

Tekniker för att mäta aktiviteten hos viktiga enzymer i glykogenmetabolismen presenteras med hjälp av en enkel spektrofotometer som arbetar i det synliga området.

Abstract

Glykogen syntetiseras som en lagringsform av glukos av ett brett spektrum av organismer, allt från bakterier till djur. Molekylen består av linjära kedjor av α1,4-bundna glukosrester med grenar införda genom tillsats av α1,6-bindningar. Att förstå hur syntesen och nedbrytningen av glykogen regleras och hur glykogen uppnår sin karakteristiska grenade struktur kräver studier av enzymerna för glykogenlagring. De metoder som oftast används för att studera dessa enzymaktiviteter använder emellertid vanligtvis reagenser eller tekniker som inte är tillgängliga för alla utredare. Här diskuterar vi ett batteri av procedurer som är tekniskt enkla, kostnadseffektiva och ändå kan ge värdefull inblick i kontrollen av glykogenlagring. Teknikerna kräver tillgång till en spektrofotometer, som arbetar i intervallet 330 till 800 nm, och beskrivs förutsatt att användarna kommer att använda engångsplastkuvetter. Procedurerna är dock lätt skalbara och kan modifieras för användning i en mikroplattläsare, vilket möjliggör mycket parallell analys.

Introduction

Glykogen är utbredd i naturen, med föreningen som finns i bakterier, många protister, svampar och djur. I mikroorganismer är glykogen viktigt för cellöverlevnad när näringsämnen är begränsande och i högre organismer som däggdjur tjänar syntes och nedbrytning av glykogen till att buffra blodsockernivån 1,2,3. Studiet av glykogenmetabolism är därför av betydelse för så olika områden som mikrobiologi och däggdjursfysiologi. Att förstå glykogenmetabolism kräver att man studerar nyckelenzymerna för glykogensyntes (glykogensyntas och förgreningsenzymet) och glykogennedbrytning (glykogenfosforylas och förgreningsenzym). Guldstandardanalyserna av glykogensyntas, fosforylas, förgrening och avförgrening av enzymaktiviteter använder radioaktiva isotoper. Till exempel mäts glykogensyntas i allmänhet i en stoppad radiokemisk analys genom att följa införlivandet av glukos från UDP-[14 C] glukos (när det gäller djur- och svampenzymer) eller ADP-[14C] glukos (i fallet med bakteriella enzymer) i glykogen 4,5. På liknande sätt mäts glykogenfosforylas i riktning mot glykogensyntes, efter införlivandet av glukos från [14C] glukos-1-fosfat i glykogen6. Förgreningsenzymet analyseras genom att mäta detta enzyms förmåga att stimulera införlivandet av [14 C] glukos från glukos-1-fosfat i a1,4-bundna kedjor av glykogenfosforylas7, och förgrenande enzymaktivitet bestäms genom att följa enzymets förmåga att införliva [14C] glukos i glykogen8 . Även om de är mycket känsliga, vilket tillåter deras användning i råcellsextrakt med låga nivåer av enzymaktivitet, är de radioaktiva substraten dyra och omfattas av de lagstadgade kraven som följer med radioisotopanvändning. Dessa hinder placerar användningen av vissa analyser utom räckhåll för många arbetstagare. Under många år har emellertid en imponerande mängd spektrofotometriska tillvägagångssätt för mätning av dessa enzymer beskrivits. I allmänhet förlitar sig dessa tillvägagångssätt i slutändan på att mäta produktionen eller konsumtionen av NADH / NADPH, eller genereringen av färgade komplex mellan glykogen och jod. Således är de enkla och kan utföras med enkla spektrofotometrar utrustade med endast volfram- eller xenonblixtlampor.

Spektrofotometriska analyser av glykogensyntas är beroende av att mäta nukleosiddifosfatet som frigörs från sockernukleotiddonatorn när glukos tillsätts till den växande glykogenkedjan 9,10. Förfarandet för mätning av glykogensyntasaktivitet som beskrivs i avsnitt 1 i protokollet nedan är en modifiering av det som beskrivs av Wayllace et al.11, och kopplingsschemat visas nedan:

(Glukos) n + UPD-glukos → (glukos)n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + fosfoenolpyruvat → pyruvat + ATP

Pyruvat + NADH + H+ → Laktat + NAD+

Glykogensyntas tillför glukos från UDP-glukos till glykogen. UDP som genereras i denna process omvandlas till UTP med nukleosiddifosfatkinas (NDP-kinas), i en reaktion som genererar ADP. ADP fungerar i sin tur sedan som ett substrat för pyruvatkinas, vilket fosforylerar ADP med fosfoenolpyruvat som fosfatgivare. Den resulterande pyruvaten omvandlas till laktat av enzymet laktatdehydrogenas i en reaktion som förbrukar NADH. Analysen kan därför utföras kontinuerligt och övervaka minskningen av absorbansen vid 340 nm när NADH konsumeras. Det är lätt anpassat för användning med enzymer som kräver ADP-glukos som glukosgivare. Här är kopplingsstegen enklare eftersom ADP som frigörs genom verkan av glykogensyntas påverkas direkt av pyruvatkinas.

Det finns en mängd olika spektrofotometriska analyser tillgängliga för bestämning av glykogenfosforylasaktivitet. I den klassiska versionen drivs enzymet bakåt, i riktning mot glykogensyntes, som visas nedan:

(Glukos) n + Glukos-1-fosfat → (glukos)n+1 + Pi

Vid tidsbestämda intervall avlägsnas alikvoter av reaktionsblandningen och mängden fosfat som frigörs kvantifieras12,13. I våra händer har denna analys varit av begränsad användning på grund av närvaron av lätt mätbart fritt fosfat i många kommersiella beredningar av glukos-1-fosfat, i kombination med de höga koncentrationerna av glukos-1-fosfat som krävs för fosforylasverkan. Snarare har vi rutinmässigt använt en alternativ analys som mäter glukos-1-fosfatet som frigörs när glykogen bryts ned av fosforylas13. Ett kopplat reaktionsschema, illustrerat nedan, används.

(Glukos) n + Pi → (glukos)n-1 + glukos-1-fosfat

Glukos-1-fosfat → glukos-6-fosfat

Glukos-6-fosfat + NADP+ → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H+

Glukos-1-fosfatet omvandlas till glukos-6-fosfat med fosfoglukomutas och glukos-6-fosfatet oxideras sedan till 6-fosfoglukonolakton, med samtidig reduktion av NADP+ till NADPH. Förfarandet som beskrivs i avsnitt 2 i protokollet nedan härrör från metoder som beskrivs av Mendicino et al.14 och Schreiber & Bowling 15. Analysen kan lätt utföras på ett kontinuerligt sätt, med ökningen av absorbansen vid 340 nm över tiden, vilket möjliggör bestämning av reaktionshastigheten.

Spektrofotometrisk bestämning av förgreningsenzymaktivitet är beroende av mätningen av glukosen som frigörs genom enzymets verkan på fosforylasgränsen dextrin16. Denna förening tillverkas genom att behandla glykogen uttömmande med glykogenfosforylas. Eftersom glykogenfosforylasverkan stoppar 4 glukosrester bort från en α1,6-grenpunkt, innehåller gränsdextrin glykogen, vars yttre kedjor har förkortats till ~ 4 glukosrester. Beredning av fosforylasgräns dextrin beskrivs här med hjälp av ett förfarande härrörande från de som utvecklats av Taylor et al.17 och Makino & Omichi18.

Debranching är en tvåstegsprocess. 4-α-glukanotransferasaktiviteten hos det bifunktionella förgreningsenzymet överför först tre glukosrester från grenpunkten till den icke-reducerande änden av en närliggande α1,4-bunden glukoskedja. Den enda, α1,6-bundna glukosrest som finns kvar vid grenpunkten hydrolyseras sedan av α1,6-glukosidasaktiviteten19. Analysen utförs vanligtvis på ett stoppat sätt, glukosen som frigörs efter en given tid (eller serie gånger) mäts i en kopplad enzymanalys som visas nedan:

(Glukos) n → (glukos)n-1 + glukos

Glukos + ATP → glukos-6-fosfat + ADP

Glukos-6-fosfat + NADP+ → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H+

Bestämningen av NADPH som produceras ger ett mått på glukosproduktion. Förfarandet som beskrivs i avsnitt 3 i protokollet nedan är baserat på ett som beskrivs av Nelson et al.16. Liksom de andra metoderna som förlitar sig på konsumtion eller generering av NADH / NADPH är analysen ganska känslig. Närvaron av amylaser eller andra glukosidaser, som också kan frigöra fri glukos från fosforylasgräns dextrin, kommer emellertid att orsaka betydande störningar (se Diskussion).

Den kolorimetriska bestämningen av förgreningsenzymaktivitet bygger på det faktum att a1,4-bundna kedjor av glukos antar spiralformade strukturer som binder till jod och bildar färgade komplex20. Färgen på det bildade komplexet beror på längden på de α1,4-länkade kedjorna. Således bildar amylos, som består av långa, till stor del oförgrenade kedjor av α1,4-bunden glukos, ett djupblått komplex med jod. Däremot bildar glykogener, vars yttre kedjor i allmänhet är i storleksordningen 6 till 8 glukosrester långa, orange-röda komplex. Om en lösning av amylos inkuberas med förgreningsenzym, resulterar införandet av grenar i amylosen i genereringen av kortare α1,4-bundna glukoskedjor. Således skiftar absorptionsmaximumet för amylos/ jodkomplexen mot kortare våglängder. Förfarandet som diskuteras här härrör från det som beskrivs av Boyer & Preiss21 och förgreningsenzymaktiviteten kvantifieras som en minskning av absorptionen av amylos/ jodkomplexet vid 660 nm över tiden.

Som det tydligt framgår av diskussionen ovan innebär det faktum att färgerna på de komplex som bildas mellan jod- och α1,4-glukoskedjor varierar med kedjelängden att absorbansspektra för glykogen/ jodkomplex bör variera med graden av glykogenförgrening. Detta är verkligen fallet, och mindre grenade glykogener / glykogener med längre yttre kedjor absorberar ljus vid en längre våglängd än glykogener som är mer grenade / har kortare yttre kedjor. Jodfärgningsreaktionen kan därför användas för att få snabba, kvalitativa data om graden av glykogenförgrening22. Den orangebruna färgen bildas när glykogenkomplex med jod inte är särskilt intensiva. Färgutvecklingen kan emellertid förbättras genom införandet av mättad kalciumkloridlösning22. Detta ökar metodens känslighet cirka 10 gånger och möjliggör klar analys av mikrogrammängder glykogen. Analysen för bestämning av förgrening som beskrivs i avsnitt 4 i protokollet nedan är anpassad från ett förfarande som utvecklats av Krisman22. Det utförs helt enkelt genom att kombinera glykogenprovet med jodlösning och kalciumklorid i en kyvett och samla absorptionsspektrumet från 330 nm till 800 nm. Absorbansens maximala skiftar mot längre våglängder när graden av förgrening minskar.

Sammantaget ger de metoder som beskrivs här enkla, tillförlitliga medel för att bedöma aktiviteterna hos de viktigaste enzymerna i glykogenmetabolismen och för att erhålla kvalitativa data om omfattningen av glykogenförgrening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bestämning av glykogensyntasaktivitet

  1. Bered stamlösningar av erforderliga reagenser enligt tabell 1 (före försöksdagen).
Komponent Vägbeskrivning
50 mM Tris pH 8,0 Lös upp 0,61 g Tris-basen i ~ 80 ml vatten.  Kyl till 4 °C.   Justera pH till 8,0 med HCl och gör volymen upp till 100 ml med vatten.
20 mM HEPES-buffert Lös upp 0,477 g HEPES i ~ 80 ml vatten.  Justera pH-värdet till 7,0 med NaOH och fyll på vatten till 100 ml.
132 mM Tris/32 mM KCl buffert pH 7,8 Lös upp 1,94 g Tris-bas och 0,239 g KCl i ~ 90 ml vatten.  Justera pH till 7,8 med HCl och fyll på vatten till 100 ml.
0,8 % vikt/v ostronglykogen Väg ut 80 mg ostronglykogen och tillsätt till vatten.  Gör den slutliga volymen upp till 10 ml med vatten och värm försiktigt/blanda för att helt lösa upp glykogen.
100 mM UDP-glukos Lös upp 0,31 g UDP-glukos i vatten och gör den slutliga volymen upp till 1 ml.  Förvaras i alikvoter, frysta vid -20 °C.   Stabil i flera månader.
50 mM ATP Lös upp 0,414 g ATP i ~ 13 ml vatten.  Justera pH-värdet till 7,5 med NaOH och fyll på vatten till 15 ml.  Förvaras i alikvoter frysta vid -20 °C.   Stabil i flera månader.
100 mM glukos-6-fosfat pH 7,8 Lös upp 0,282 g glukos-6-fosfat i ~ 7 till 8 ml vatten.  Justera pH-värdet till 7,8 med NaOH.  Gör volymen upp till 10 ml med vatten.  Förvaras fryst i alikvoter vid -20 °C.   Stabil i minst sex månader.
40 mM fosfoenolpyruvat Lös upp 4 mg fosfoenolpyruvat i 0,5 ml 20 mM HEPES buffert pH 7,0.  Förvaras vid -20 °C.   Stabil i minst 1 vecka.
0,5 m MnCl2 Lös upp 9,90 g MnCl2i en slutlig volym av 100 ml vatten.
NDP-kinas Rekonstituera frystorkat pulver med tillräckligt med vatten för att ge 1 U/μl lösning.  Bered alikvoter, frys i flytande kväve och förvara vid -80 °C.   Stabil i minst 1 år.

Tabell 1: Stamlösningar som krävs för analys av glykogensyntasaktivitet.

  1. På analysdagen, förbered en ny arbetslösning av 4 mM NADH genom att lösa 4,5 mg NADH i 1,5 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0. Förvara på is, skyddad från ljuset.
  2. Tina stamlösningar av UDP-glukos, ATP, fosfoenolpyruvat och NDP-kinas på is.
  3. Förvärm ett vattenbad till 30 °C.
  4. Ställ in varje glykogensyntasanalys i ett 1,5 ml rör genom att tillsätta de reaktionsblandningsreagenser som anges i tabell 2.
Komponent Volym (μl)
160 mM Tris/32 mM KCl buffert pH 7,8 250
Vatten 179
100 mM glukos-6-fosfat, pH 7,8 58
0,8 % w/v ostronglykogen 67
50 mM ATP 80
4 mM NADH 80
100 mM UDP-glukos 28
40 mM fosfoenolpyruvat 20
0,5 m MnCl2 8
Slutlig volym 770

Tabell 2: Sammansättningsreaktionsblandning för analys av glykogensyntasaktivitet.

OBS: För att underlätta installationen kan en huvudblandning göras som innehåller tillräckligt med vart och ett av de ovan angivna reagenserna för att slutföra antalet planerade analyser.

  1. Förbered en blank reaktion, där NADH i ovanstående blandning ersätts med vatten. Överför till en engångsmetakrylatkyvett och använd denna för att ställa in nollan på spektrofotometern vid 340 nm.
  2. Ta en 770 μl av alikvoten av reaktionsblandningen i ett 1,5 ml rör. Tillsätt 2 μl NDP-kinas och 2 μl pyruvatkinas/laktatdehydrogenasblandning, blanda försiktigt och inkubera vid 30 °C i 3 minuter för att förvärma reaktionsblandningen.
  3. Tillsätt 30 μl av provet innehållande glykogensyntas i 20 mM Tris-buffert, pH 7,8. Blanda och överför reaktionsblandningen till en engångsmetakrylatkuvett.
  4. Placera kyvetten i spektrofotometern och registrera absorbansen vid 340 nm vid tidsbestämda intervall i 10 till 20 minuter. Plotta absorbanserna som erhållits mot tiden.
    OBS: En reaktion där glykogensyntasprovet ersätts med 20 mM Tris-buffert bör utföras för att kontrollera för icke-enzymatisk oxidation av NADH. Beroende på provets renhet kan andra kontrollreaktioner krävas. Se Diskussion för mer information.
  5. Bestäm reaktionshastigheten (se Resultat för mer information).

2. Bestämning av glykogenfosforylasaktivitet

  1. Bered stamlösningar enligt tabell 3 (före försöksdagen).
Komponent Vägbeskrivning
125 mM RÖR pH 6,8 Lös upp 3,78 g RÖR i vatten.  Justera pH-värdet till 6,8 med NaOH och fyll på vatten till 100 ml.
8% w/v ostronglykogen Väg ut 0,8 g ostronglykogen och tillsätt till vatten.  Gör den slutliga volymen upp till 10 ml med vatten och värm försiktigt/blanda för att lösa upp glykogen.  Förvaras fryst vid -20 °C.
200 mM Nafosfat pH 6,8 Lös upp 2,63 g Na2 HPO 4,7H2O och 1,41 g NaH2PO4. H2O i vatten.  Ta upp volymen till 100 ml med vatten.
1 mM glukos-1,6-bisfosfat Lös upp 2 mg glukos-1,6-bisfosfat i 4 ml vatten.  Alikvot och förvaras fryst vid -20 °C.   Stabil i minst flera månader.
10 mM NADP Lös upp 23 mg NADP i 3 ml vatten.  Alikvot och förvaras fryst vid -20 °C.   Stabil i minst flera månader.

Tabell 3: Stamlösningar som krävs för att analysera glykogenfosforylasaktivitet.

  1. Förvärm ett vattenbad till 30 °C
  2. Ställ in varje glykogenfosforylastest i ett 1,5 ml rör genom att tillsätta de reaktionsblandningsreagenser som anges nedan (tabell 4).
Komponent Volym (μl)
125 mM RÖR buffert pH 6,8 160
Vatten 70
8% w/v ostronglykogen 100
200 mM Na fosfat 6,8 400
1 mM glukos-1,6-bisfosfat 20
10 mM NADP 20
Slutlig volym 770

Tabell 4: Sammansättningsreaktionsblandning för analys av glykogenfosforylasaktivitet.

OBS: För att underlätta installationen kan en huvudblandning göras som innehåller tillräckligt med vart och ett av de ovan angivna reagenserna för att slutföra antalet planerade analyser.

  1. Bered en blindreaktion som innehåller de komponenter som anges i tabell 4 men tillsätt ytterligare 30 μl 25 mM PIPES-buffert, pH 6,8 (berett genom utspädning av 125 mM PIPES-buffert 1/5 med vatten). Överför till en engångsmetakrylatkyvett och använd för att ställa in nollan på spektrofotometern vid 340 nm.
  2. Ta en alikvot på 770 μl reaktionsblandning i ett 1,5 ml rör. Tillsätt 1 μl glukos-6-fosfatdehydrogenas och 1 μl fosfoglukomutas, blanda försiktigt och inkubera vid 30 °C i 3 minuter för att förvärma reaktionsblandningen.
  3. Tillsätt 30 μl av provet innehållande glykogenfosforylas i 25 mM PIPES-buffert, pH 6,8. Blanda och överför reaktionsblandningen till en engångsmetakrylatkuvett.
  4. Placera kyvetten i spektrofotometern och registrera absorbansen vid 340 nm vid tidsbestämda intervall i 10 till 20 minuter. Plotta absorbanserna som erhållits mot tiden.
    OBS: En reaktion där glykogenfosforylas ersätts med 25 mM PIPES-buffert bör inkluderas. Beroende på renheten hos glykogenfosforylasprovet kan andra kontroller också behövas (se Diskussion för detaljer).
  5. Bestäm reaktionshastigheten (se Representativa resultat för mer information).

3. Bestämning av glykogenavgrenande enzymaktivitet

  1. Bered stamlösningar enligt tabell 5 (före försöksdagen).
Komponent Vägbeskrivning
100 mM maleat buffert Lös upp 1,61 g maleinsyra i ~ 80 ml vatten.  Justera pH-värdet till 6,6 med NaOH och gör den slutliga volymen upp till 100 ml med vatten.
300 mM trietanolaminhydroklorid/ 3 mMMgSO4 pH 7,5 Lös upp 27,85 g trietanolaminhydroklorid och 0,370 gMgSO4. 7H2O i ~ 400 ml vatten.  Justera pH-värdet till 7,5 med NaOH och fyll på vatten till en slutlig volym på 500 ml.
150 mM ATP/12 mM NADP Lös upp 1,24 g ATP i ~ 10 ml vatten.  Övervaka pH och tillsätt NaOH för att upprätthålla ett pH på ~ 7,5 när ATP löses upp.  Tillsätt 0,138 g NADP.  Justera pH-värdet till ~ 7,5 med NaOH och fyll på vatten till en slutlig volym på 15 ml. Förvaras i alikvoter vid – 20 °C. Stabil i flera månader.
50 mM Na fosfatbuffert pH 6,8 Lös upp 32,81 g Na 2 HPO4,7H 2O och 17,61 gNaH2PO4. H2O i vatten.  Ta upp volymen till en slutlig volym på 5 L med vatten.

Tabell 5: Stamlösningar som krävs för att analysera glykogenavgrenande enzymaktivitet.

  1. Förbered fosforylasgränsen dextrin
    1. Lös upp 0,3 g ostronglykogen i 10 ml 50 mM natriumfosfatbuffert, pH 6,8.
    2. Lös upp tillräckligt frystorkat fosforylas A-pulver för att ge 60 U aktivitet i 50 mM fosfatbuffert, pH 6,8.
      OBS: Beroende på mängden fosforylas A som köpts kommer den massa som behövs att variera men är i allmänhet mellan 5 och 10 mg pulver.
  2. Tillsätt 60 U fosforylas A till glykogenlösningen och överför till en dialyspåse. Dialysera vid rumstemperatur mot 1 liter 50 mM natriumfosfatbuffert, pH 6,8 i 8 timmar. Byt till den färska dialysbufferten och fortsätt inkubationen över natten.
  3. Tillsätt ytterligare 10 U fosforylas A och byt till färsk dialysbuffert. Efter 8 h, byt igen till färsk dialysbuffert och fortsätt inkubationen över natten.
  4. Överför innehållet i dialyspåsen till ett centrifugrör och koka i 10 min. Kyl på is och centrifugera sedan vid 10 000 x g i 15 min.
  5. Överför supernatanten till en dialyspåse och dialysera i 8 timmar mot tre byten av 2 liter destillerat vatten.
  6. Överför innehållet i dialyspåsen till ett 50 ml centrifugrör. Mät volymen och tillsätt två volymer iskall absolut etanol för att fälla ut gränsvärdet dextrin. Låt röret stå på is i 30 min.
    OBS: En vit fällning bör börja bildas omedelbart efter tillsats av etanol men, om den inte gör det, tillsätt en droppe på 3 M NaCl.
  7. Centrifugera vid 15 000 x g i 15 minuter och kassera supernatanten. Skölj den vita pelleten av gränsdextrin två gånger med 66% v / v etanol med ~ 30 ml för varje sköljning.
  8. Överför gränsen dextrin till en murbruk och låt lufttorka helt. När gränsen dextrin är torr, slipa till ett pulver med en stöt och överför till ett lämpligt kärl för lagring; torka vid 4 °C.
  9. För användning som avförgrenande enzymsubstrat, förbered en 1% w / v lösning i vatten.
  10. Förvärm ett vattenbad till 30 °C.
  11. Förvärm ett värmeblock eller vattenbad till 95 °C.
  12. Bered fyra 1,5 ml rör som vardera innehåller 100 μl maleatbuffert, 80 μl fosforylasgränsdextrin och 10 μl vatten. Dessa rör kommer att användas för att genomföra den förgrenande enzymanalysen. Märk två av rören Reaktion och de andra två rören Kontroll.
  13. Tillsätt 10 μl av det avförgrenande enzymprovet med tidsbestämda intervall till reaktionsrören och 10 μl buffert som användes för att bereda förgreningsenzymprovet till kontrollrören. Inkubera vid 30 °C.
  14. Vid definierade tidpunkter (t.ex. inkubation på 5, 10 och 20 minuter) drar du upp 50 μl från varje reaktions- och kontrollrör och placerar dem omedelbart i värmeblocket eller vattenbadet vid 95 °C. Värm i 3 min.
  15. Centrifugera vid 15 000 x g i 2 minuter för att avlägsna utfällt protein.
    OBS: Vid denna tidpunkt kan proceduren stoppas vid behov. De uppvärmda proverna kan förvaras frysta vid -20 °C tills de fortsätter till mätningen av frisatt glukos (steg 17 nedan).
  16. Mätning av frisatt glukos
    1. Överför 40 μl av supernatanten från de uppvärmda proverna till engångsmetaakrylatkvetter och tillsätt 833 μl trietanolaminhydroklorid/magnesiumsulfatbuffert, 67 μl NADP/ATP-blandning och 60 μl vatten. Blanda genom att pipettera upp och ner försiktigt, var försiktig så att du inte introducerar luftbubblor.
      OBS: För att underlätta installationen kan en huvudblandning göras som innehåller tillräckligt med vart och ett av de ovan angivna reagenserna för att slutföra antalet planerade analyser.
    2. Förbered en blindreaktion genom att kombinera 100 μl maleatbuffert, 80 μL fosforylasgränsdextrin och 20 μl vatten. Blanda väl och överför 40 μL till en engångsmetakrylatkyvett. Tillsätt 833 μl trietanolaminhydroklorid/magnesiumsulfat etc. enligt beskrivningen i steg 3.17.1.
    3. Ställ in nollan på spektrofotometern vid 340 nm med hjälp av den tomma reaktionen.
    4. Tillsätt 0,5 μl glukos-6-fosfatdehydrogenas till varje kyvett. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner långsamt. Inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter och registrera sedan absorbansen vid 340 nm.
      OBS: Absorptionsvärdena bör vara låga, vilket innebär liten kontaminering av proverna med glukos-6-fosfat.
    5. Tillsätt 0,5 μl hexokinas till varje kyvett. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner långsamt. Inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter och registrera sedan absorbansen vid 340 nm.
    6. Fortsätt inkubationen vid rumstemperatur i ytterligare 5 minuter. Spela in absorbansen vid 340 nm igen. Om absorptionen har ökat från den som registrerats vid 15 min, fortsätt inkubationen i ytterligare 5 minuter och kontrollera absorptionen igen. Registrera den slutliga absorptionen vid 340 nm erhållen.
    7. Subtrahera för varje prov den absorbans vid 340 nm som registrerats efter tillsats av glukos-6-fosfatdehydrogenas från den slutliga absorbans som erhållits efter tillsats av hexokinas. Plotta de erhållna värdena mot den tid som motsvarande prov hade inkuberats med avförgreningsenzym.

4. Bestämning av glykogenförgreningsenzymaktivitet

  1. Före försöksdagen, bered jod/KI-lösning genom att först lösa upp 2,6 g KI i 10 ml vatten. Väg upp 0,26 g jod i en dragskåp och tillsätt till KI-lösningen.
    VARNING: Jod är skadligt vid kontakt med huden eller vid inandning. Blanda för att lösa upp joden och förvara vid 4 °C, skyddad från ljuset. Förbered även 125 mM RÖRBUFFERT, pH 6,8 (se tabell 3).
  2. När du börjar experiment, gör ett fungerande lager av surgjort jodreagens.
    1. Ta 45,7 ml vatten i ett 50 ml rör och tillsätt 150 μl jod/KI-lösning följt av 150 μl 1 M HCl.
    2. Blanda väl och förvara vid 4 °C, skyddad från ljuset. Lösningen är stabil i minst 3 dagar under dessa förhållanden.
  3. På experimentdagen, gör en ny 10 mg / ml lösning av amylos.
    1. Väg upp 50 mg amylos och överför till ett 15 ml rör.
    2. Tillsätt 200 μl absolut etanol och skaka försiktigt.
    3. Tillsätt 500 μl 2 M KOH och skaka försiktigt.
      VARNING: KOH orsakar allvarliga hudbrännskador och ögonskador. Använd lämplig personlig skyddsutrustning.
    4. Tillsätt 0,5 ml vatten medan du skakar försiktigt. Om amylos inte löser sig helt, tillsätt ytterligare 0,5 ml vatten.
    5. Justera pH till ~ 6,5 till 7,0 med 1 M HCl.
      VARNING: HCl kan orsaka irritation i ögon, hud och luftvägar. Använd lämplig personlig skyddsutrustning.
    6. Tillsätt vatten för att nå en slutlig volym på 5 ml.
    7. Sterilisera genom passage genom ett 0,2 μm sprutändfilter och förvara vid rumstemperatur. Kyl inte eller frys in.
  4. Förvärm ett vattenbad till 30 °C.
  5. Bered tolv 1,5 ml rör, var och en innehållande 1 ml surgjort jodreagens. Ställ åt sidan på bänken. Dessa kommer att användas för att stoppa förgreningsenzymreaktionen.
  6. Bered fyra 1,5 ml rör som vardera innehåller 150 μl amylos, 150 μL PIPES-buffert och 45 μl vatten. Dessa rör kommer att användas för att genomföra förgreningsenzymanalysen. Märk två av rören Reaktion och de andra två rören Kontroll.
  7. Tillsätt 5 μL förgreningsenzymprov till reaktionsrören med tidsbestämda intervall och 5 μl buffert som användes för att bereda förgreningsenzymprovet till kontrollrören. Inkubera vid 30 °C.
  8. Vid definierade tidpunkter (t.ex. 5, 10 och 15 minuters inkubation), dra upp 10 μL från varje reaktions- och kontrollrör och tillsätt till de 1,5 ml rör som innehåller 1 ml surgjort jodreagens. Tillsätt ytterligare 140 μl vatten och blanda väl. Överför till engångskuvetter.
    OBS: Proverna ska vara blåa och lösningen ska vara fri från fällning. Den bildade färgen är stabil i minst 2 timmar vid rumstemperatur.
  9. Bered ett prov som innehåller 1 ml surgjort jodrreagens och 150 μl vatten. Blanda väl och överför till en kyvett. Använd denna kyvett för att ställa in nollan på spektrofotometern vid 660 nm.
  10. Läs absorbansen för vart och ett av de tolv proverna vid 660 nm. Bestäm hastigheten för förgreningsenzymreaktionen genom att subtrahera absorbansen erhållen i närvaro av förgreningsenzym (reaktion) från absorbansen när inget förgreningsenzym är närvarande (kontroll) vid varje tidpunkt. Se Representativa resultat för mer information.

5. Kvalitativ bedömning av glykogenförgrening

  1. Förbered mättad kalciumkloridlösning genom att tillsätta 74,5 g vattenfri kalciumklorid till ~ 40 ml vatten och omrörning. Tillsätt lite mer vatten och fortsätt att röra om. Gör volymen upp till 100 ml med vatten och fortsätt omrörningen tills CaCl2är helt upplöst.
  2. Bered ett arbetslager av jod/CaCl2 färgreagens genom att blanda 50 μl KI/jod stamlösning (se steg 4.1 ovan) med 13 ml mättad CaCl2-lösningi ett 15 ml rör. Blanda väl och förvara vid 4 °C, skyddad från ljuset. Lösningen är stabil i minst 1 vecka under dessa förhållanden.
  3. Bestämning av förgrening
    1. I ett 1,5 ml rör, kombinera 650 μL jod / CaCl2 färgreagensbuljong med 100 μL vatten och blanda noggrant. Överför lösningen till en engångsmetakrylatkvett.
      OBS: Lösningen i kyvetten ska vara klar och ljusgul i färgen.
    2. Placera i spektrofotometern och samla in ett bakgrundsspektrum från 330 nm till 800 nm i ett våglängdsskanningsläge.
    3. I ett 1,5 ml rör, kombinera 650 μL arbetsjod / CaCl2 färgreagens med 50 μg ostronglykogen. Bringa den slutliga volymen till 750 μl med vatten och blanda noggrant. Överför lösningen till en engångsmetakrylatkvett.
      OBS: Lösningen i kyvetten ska vara klar och en djup orange/brun färg.
    4. Placera i spektrofotometern och samla ett absorptionsspektrum från 330 nm till 800 nm.
    5. Upprepa steg 4.4.3 till 4.4.4 med 50 μg amylopektin och 30 μg amylos.
      OBS: Amylopektinprovet ska vara gult/grönt och amylosprovet ska vara grönt/blått. Båda proverna ska vara tydliga. De bildade färgade komplexen är stabila, utan förändring i absorptionsspektrumet, i minst 1 h vid rumstemperatur.
    6. För att få en indikation på den grenade strukturen hos ett okarakteriserat glykogenprov, kombinera 25 μg till 50 μg glykogen med 650 μl arbetsjod / CaCl2 färgreagens. Fortsätt som ovan, bringa volymen till 750 μL med vatten, blanda noggrant och överför till en metakrylatkyvett.
      OBS: Glykogenprovet bör ge en gul / orange till orange / brun färg beroende på graden av förgrening (längden på yttre kedjor) av det närvarande glykogenet. Återigen bör provet vara klart. Se Representativa resultat för mer information.
    7. Samla absorptionsspektrumet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bestämning av glykogensyntasaktivitet
Figur 1 visar representativa resultat från glykogensyntasanalyser med renade enzymer. I panel A, efter en liten fördröjning, var det en linjär minskning av absorptionen vid 340 nm över tiden under en period av cirka 12 minuter. Förändringshastigheten i absorptionen i figur 1A var ~0,12 absorbansenheter/min. En förändringshastighet i absorbans mellan ~0,010 och ~0,20 absorbansenheter/min är optimal och mängden glykogensyntas som tillsätts bör justeras för att ge värden inom detta intervall. I panel B visas resultatet av att tillsätta för mycket glykogensyntas till analysen. Här var reaktionen klar inom de första 2 minuterna. Kontrollreaktionen, som i dessa fall inte innehöll något glykogensyntas, visade ingen mätbar minskning av absorbansen över tid. Som utvecklats i diskussionen är användningen av vävnadshomogenater i denna analys fullt möjlig, även om ytterligare kontrollreaktioner krävs.

Protokollet som beskrivs här använder ostronglykogen som substrat, vilket fungerar bra med glykogensyntaser från många olika arter. Det bör dock noteras att glykogensyntaser kan uppvisa ganska varierande aktivitet beroende på vilken typ av glykogen som används. Därför är det lämpligt att undersöka en mängd olika former av glykogen innan någon detaljerad studie påbörjas.

Det angivna protokollet innefattar glukos-6-foposfat i reaktionsblandningen, eftersom många glykogensyntaser aktiveras allosteriskt av denna förening 9,23,24,25,26. Genomförande av analyser i närvaro och frånvaro av glukos-6-fosfat (som utgör reaktionsvolymen med vatten) möjliggör beräkning av aktivitetsförhållandet -/+ glukos-6-fosfat, vilket är en användbar indikation på fosforyleringstillståndet för däggdjurs- och svampglykogensyntaser 1,27.

Bestämningen av glykogensyntasaktivitet från förändringen i absorbans är ganska enkel. Utrotningskoefficienten för NADH tas som 6220 M-1 cm-1, vilket möjliggör beräkning av förändringshastigheten i NADH-koncentrationen från absorbansförändringen enligt följande:

En förändringshastighet i absorption på 0,12 enheter/min motsvarar 0,12/6220 = 1,93 x 10-5 mol/L/min förändring i NADH-koncentration. Volymen i kyvetten var 0,8 ml, vilket innebär att förändringen i mängd NADH var: 1,93 x 10-5 x 0,8 x 10-3 = 3,46 x 10-8 mol/min. Volymen tillsatt enzym var 60 μL, 3,46 x 10-8 x (1000 / 60) = 5,76 x 10-7 mol NADH konsumerat / min / ml enzym.

Eftersom det finns ett en-till-ett-förhållande mellan den konsumerade NADH och glukosen som ingår i glykogen, kan reaktionshastigheten uttryckas som 5,76 x 10-7 mol glukos införlivad / min / ml.

När enzymprovets proteininnehåll är känt kan den specifika enzymaktiviteten uttryckas som μmolglukosinnehåll/min/mg-protein eller nmol-glukosinkorporerat/min/mg-protein, beroende på vad som är tillämpligt.

Som nämnts i introduktionen är protokollet lätt anpassat för att mäta aktiviteten hos glykogensyntaser som använder ADP-glukos som glukosgivare. Detta uppnås genom enkel substitution av UDP-glukos med ADP-glukos i reaktionsblandningen. Vidare utelämnas både NDP-kinas och ATP från reaktionsblandningen, eftersom ADP som frigörs under glykogensyntasverkan är ett direkt substrat för pyruvatkinas.

Figure 1
Figur 1: Representativa resultat från analyser av glykogensyntasaktivitet. Spektrofotometern var inställd på att ta en avläsning per min under en total tid på 20 min. Panel A visar den förväntade korta fördröjningsfasen följt av en linjär minskning av absorbansen med tiden (experimentell). Det fanns ingen minskning av absorptionen som noterades i kontrollreaktionen. Reaktionshastigheten beräknas från lutningen av absorbansförändringen i den linjära fasen (från 5 till 16 min). Panel B visar resultatet av att tillsätta för mycket enzym. Här är NADH uttömd inom 2 min. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bestämning av glykogenfosforylasaktivitet
Figur 2 visar representativa data från en glykogenfosforylasanalys med användning av renat enzym. Med preparatet som användes här var analysen linjär i cirka 3 minuter. Infällningen visar en regressionslinje som dras genom punkterna från tiden 0 till 2,5 min. Lutningen på denna linje visar att absorbansförändringen är 0,022 absorbansenheter/min. En absorbansökning på cirka 0,01 till 0,04 är optimal, eftersom analysen kommer att avvika från linjäriteten ganska snabbt om för mycket enzym är närvarande. Hastigheten för NADPH-bildning beräknas utifrån extinktionskoefficienten som, liksom NADH, är 6220 M-1 cm-1. För varje 1 mol NADPH som bildades hade en mol glukos-1-fosfat producerats genom verkan av glykogenfosforylas. Enzymaktivitet kan därför uttryckas som mängden glukos-1-fosfat som frigörs från glykogen per tidsenhet, efter en beräkning som liknar den som beskrivs ovan.

Reaktionsbetingelserna är lätt anpassningsbara för de fosforylaser som är känsliga för allosterisk modulering. De nödvändiga effektorerna ingår helt enkelt i reaktionsmasterblandningen och ersätter en del av vattnet. En viktig varning är att effektorn i sig måste visas att den inte påverkar aktiviteten hos kopplingsenzymerna, fosfoglukomutas och glukos-6-fosfatdehydrogenas.

Slutligen, som med glykogensyntas som beskrivs ovan, kan den typ av glykogen som används som substrat påverka reaktionshastigheten. Medan ostronglykogen fungerar bra med fosforylaser från många arter, kanske det inte alltid är det optimala valet.

Figure 2
Figur 2: Representativa resultat från analyser av glykogenfosforylasaktivitet. Spektrofotometern var inställd på att ta en avläsning var 30: e minut under en total tid på 10 minuter. Det registrerades en stadig ökning av absorbansen i närvaro av glykogenfosforylas (experimentell), medan reaktionen utan tillsatt fosforylas förblev vid baslinjen (kontroll). Insatsen visar en utvidgning av den ursprungliga reaktionsperioden, vilket visar linjäriteten i produktbildningen med avseende på tid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bestämning av glykogenförgrenande enzymaktivitet
De data som visas i figur 3 är representativa för en glykogenförgreningsenzymanalys med användning av renat förgreningsenzym. Vid varje tidpunkt subtraherades förändringen i absorption som inträffade i frånvaro av tillsatt förgreningsenzym (Kontroll) från förändringen i absorption som inträffade i närvaro av förgreningsenzym (reaktion). De resulterande absorbansvärdena plottades sedan. Som ovan beräknas en förändringshastighet för NADPH-koncentrationen från kurvans initiala lutning genom regressionsanalys. I det här exemplet var ökningen av NADPH per tidsenhet linjär i 10 minuter, med en lutning på 0,0079 absorbansenheter/min. Även om dessa data är fullt användbara, skulle tillsatsen av något mindre enzym ha gett en grundare lutning och möjliggjort en längre linjär fas. Alternativt kan ytterligare avläsningar göras genom att ta bort alikvoter för mätning vid 2 min och 7 min inkubation. Bestämning av förgreningsenzymaktivitet är mycket enkel, eftersom 1 mol NADPH bildas för varje 1 mol glukos som frigörs av α1,6-glukosidasaktiviteten hos förgreningsenzymet. Således kan reaktionshastigheten uttryckas som mängden glukos som frigörs från fosforylasgräns dextrin per tidsenhet, enligt samma typ av beräkning som användes för glykogensyntas- och fosforylasanalyserna ovan.

Figure 3
Figur 3: Representativa resultat från analyser av glykogenavgrenande enzymaktivitet. Prover av fosforylasgränsdextrin behandlades med förgreningsenzym i 5, 10, 20 eller 40 minuter. Ökningen av absorbansen vid 340 nm, producerad som NADP reducerades till NADPH i en kopplad enzymanalys, mättes i prover tagna vid var och en av dessa tidpunkter. Reaktionen visade en linjär fas som kvarstod i minst 10 minuter.

Bestämning av glykogenförgreningsenzymaktivitet
Figur 4 visar data från glykogenförgreningsenzymanalyser. Vid var och en av de angivna tidpunkterna mättes absorbansen hos kontroll- och reaktionsproverna. Reaktionsprovets absorbans vid 660 nm subtraherades från motsvarande kontrollprov, och absorbansskillnaden plottades mot tiden. En regressionslinje drogs sedan genom punkterna (panel A). Reaktionshastigheten kan uttryckas helt enkelt som förändringen i absorbans vid 660 nm per tidsenhet. Den maximala förändringen i absorbans som kan uppstå i denna analys är endast ~ 0,4 absorbansenheter, vilket representerar maximal förgrening av den tillsatta amylos av förgreningsenzymet (panel B). Dessutom, när reaktionsrörens absorbans sjunker mer än ~ 0,2 absorbansenheter under kontrollens, ligger analysen inte längre inom det linjära området och ingen uppskattning av reaktionshastigheten kan göras (panel B).

Amylosen som används som substrat i denna procedur börjar lämna lösningen ganska lätt om den kyls eller fryses och sedan tinas. Därför är det viktigt att göra amylossubstratlösningen färsk och att säkerställa att ingen fällning har bildats före användning.

Figure 4
Figur 4: Representativa resultat från analyser av glykogenförgreningsenzymaktivitet. Prover av amylos behandlades med förgreningsenzym. Alikvoter avlägsnades vid de angivna tidpunkterna och tillsattes till ett surgjort jodreagens. Absorbansen hos det bildade amylos/jodkomplexet mättes sedan vid 660 nm. De data som visas representerar skillnaden i absorbans mellan kontrollinkubationer som saknade förgreningsenzym och reaktioner som innehöll förgreningsenzym. Panel A visar en minskning av absorbansen vid 660 nm på grund av avförgrenande enzymaktivitet, som var linjär i ~ 20 min. Panel B illustrerar analysens smala dynamiska omfång, där den maximala förändringen i absorbans som kan produceras är ~ 0,4 absorbansenheter och linjäritet går förlorad när förändringen i absorption är ~ 0,2 absorbansenheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kvalitativ bedömning av omfattningen av glykogenförgrening
Amylos, amylopektin, fosforylasgräns dextrin, glykogen isolerad från jäst kombinerades med jod / mättad kalciumkloridlösning och absorptionsspektra för de resulterande komplexen samlades in (Figur 5). Med hjälp av massorna av glykogen, amylopektin och amylos som anges i protokollet som beskrivs ovan bör den maximala absorbansavläsningen vara cirka 0,7 till 0,8, som visas här (paneler A och B). Absorbansmaxima för amylos och amylopektin är cirka 660 nm och 500 nm respektive 385 nm. Fosforylasgräns dextrin inkluderades här, eftersom insamling av absorbansspektrumet för fosforylasgräns dextrin / jodkomplex ger en snabb kontroll av omfattningen av fosforylasuppslutning som uppnås under beredningen av detta förgrenande enzymsubstrat. Glykogen från de flesta källor ger två toppar, en vid cirka 400 nm och en andra topp vid 460 nm (figur 5B). Vänsterförskjutningar i glykogenets absorbansspektra indikerar ökad förgrening/minskad yttre kedjelängd. Omvänt indikerar högerförskjutningar minskad förgrening / ökad yttre kedjelängd.

Den mättade kalciumkloridlösningen är tät och de tillsatta glykogenproverna kommer att bilda ett lager över toppen när de tillsätts. Därför behövs noggrann blandning för att erhålla en homogen lösning. Dessutom, om de använda kolhydratproverna inte är helt upplösta innan de blandas med kalciumkloridlösningen, kommer mörkfärgningsaggregat att bildas i kyvetten. Dessa aggregat kommer uppenbarligen att hindra insamlingen av ett absorptionsspektrum och det är viktigt att se till att lösningen i kyvetten är klar innan du fortsätter med några mätningar.

Figure 5
Figur 5: Representativa resultat från den kvalitativa bedömningen av glykogenförgrening. Prover av renat fosforylasgränsdextrin, amylopektin, amylos (panel A) eller glykogen (panel B) kombinerades med jod/mättad kalciumkloridlösning och absorptionsspektra för de resulterande komplexen mättes från 330 nm till 800 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I allmänhet är de viktigaste fördelarna med alla presenterade metoder deras låga kostnad, lätthet, hastighet och brist på beroende av specialutrustning. Den största nackdelen som de alla delar är känslighet jämfört med andra tillgängliga metoder. Känsligheten hos de förfaranden som involverar produktion eller konsumtion av NADH / NADPH är lätt att uppskatta. Med tanke på att utrotningskoefficienten för NADH / NADPH är 6,22 M-1 cm-1 , indikerar enkel aritmetik att ~ 10-20 μM förändringar i koncentration lätt kan detekteras. Med analysvolymerna som beskrivs i den aktuella artikeln motsvarar detta förmågan att mäta kvantiteter i intervallet ~ 10-20 nmol. Förmodligen är detta ganska känsligt. Det är emellertid möjligt att justera den specifika aktiviteten hos radiomärkta substrat så att känsligheten kan ökas utöver gränsen för de spektrofotometriska analyserna ganska lätt. Även om förgreningsenzymanalysen och den kvalitativa bedömningen av glykogenförgrening båda är beroende av bildandet av komplex mellan jod och a1,4-bundna glukospolymerer, är utgången från varje analys annorlunda och deras känslighet är också olika. Specifika överväganden för var och en av de beskrivna analyserna diskuteras nedan.

Bestämning av glykogensyntasaktivitet
Den kopplade enzymanalysen som beskrivs här möjliggör kontinuerlig analys av glykogensyntasaktivitet, vilket är användbart vid bestämning av kinetiska parametrar. Det är också lätt skalbart och en mycket liknande procedur har beskrivits för användning i mikrotiterplattor, vilket möjliggör mycket parallella mätningar av enzymaktivitet28. Vi använder rutinmässigt denna analys med renade, rekombinanta glykogensyntaser29. De beskrivna förfarandena utvecklades dock ursprungligen för användning i vävnadshomogenater (se till exempel Danforth10 och Leloir et al.9). En varning här är att vävnadshomogenatet måste spädas på lämpligt sätt före användning. Utspädningen är nödvändig för att minska homogenatets grumlighet och interferens från konkurrerande enzymer/substrat i homogenatet. För att ta hänsyn till NADH-konsumtion som inte är beroende av glykogensyntasaktivitet bör dessutom blindreaktioner som innehåller alla reaktionskomponenter utom UDP-glukos inkluderas. Glykogensyntasaktiviteten bestäms sedan genom att subtrahera förändringshastigheten i NADH-absorbans i frånvaro av UDP-glukos från den som erhållits i närvaro av denna förening.

Bestämning av glykogenfosforylasaktivitet
Liksom glykogensyntasanalysen kan den spektrofotometriska mätningen av fosforylasaktivitet utföras på ett kontinuerligt sätt, medan andra fosforylasanalyser stoppasanalyser 13. Det är också lätt att anpassa för användning i mikrotiterplattor eller andra applikationer med hög genomströmning15. Återigen kräver dess användning med vävnadshomogenater lämplig utspädning för att minska grumlighet / störande reaktioner. Till exempel är glukos-6-fosfat en ganska riklig metabolit och dess närvaro i ett vävnadshomogenat kommer att resultera i NADPH-produktion via glukos-6-fosfatdehydrogenaskopplingsenzymet oberoende av fosforylasaktivitet. Vid arbete med vävnadshomogenater bör kontrollreaktioner som innehåller lämpligt utspätt vävnadshomogenat och alla andra analyskomponenter utom fosfat och glykogen inkluderas. Fosforylasaktiviteten beräknas sedan genom att subtrahera NADPH-produktionen i frånvaro av glykogen/fosfat från det som sker i närvaro av dessa föreningar. Särskilda rekommendationer om lämplig grad av utspädning av olika typer av vävnadsextrakt från däggdjur finns i Mezl et al.13.

Bestämning av glykogenförgrenande enzymaktivitet
Även om det här beskrivs som en stoppad analys, kan denna procedur lätt anpassas och utföras på ett kontinuerligt sätt16. Eftersom analysen är beroende av produktion av glukos måste dess användning i råvävnadsextrakt överväga frisättning av glukos från fosforylasgränsdextrin av andra enzymer än förgreningsenzym och generering av glukos genom verkan av sådana enzymer på endogent glykogen som finns i vävnadsextraktet. Frågan om endogent glykogen behandlas lätt med en kontrollreaktion till vilken ingen fosforylasgräns dextrin tillsätts. Förekomsten av andra α-glukosidasaktiviteter kan uppskattas i parallella reaktioner där maltos, snarare än fosforylasgräns dextrin, är närvarande som ett substrat.

Bestämning av glykogenförgreningsenzymaktivitet
Av de olika kvantitativa analyser som diskuteras är den kolorimetriska förgreningsenzymanalysen den överlägset minst känsliga. Det har faktiskt uppskattats att känsligheten är cirka 50-100 gånger mindre än den som uppnås med den radiokemiska metoden, där stimulering av glykogenfosforylasreaktionen genom tillsats av förgreningsenzym mäts21. I likhet med den förgrenande enzymanalysen är förgreningsenzymanalysen också känslig för närvaron av förorenande glukosidasaktiviteter, eftersom matsmältningen av amylos kommer att påverka jodbindningen. Vissa lösningar har föreslagits för att tillåta användning av analyser liknande det som beskrivs här i närvaro av förorenande glukosidasaktiviteter30. Enligt vår uppfattning är denna analys dock bäst lämpad för studier av renade eller delvis renade glykogenförgreningsenzymer, där sådana störande aktiviteter är minimala eller frånvarande.

Kvalitativ bedömning av omfattningen av glykogenförgrening
Den detaljerade analysen av glykogenförgrening är ganska mödosam, vanligtvis involverar en kombination av enzymatisk matsmältning, kemisk modifiering och en mängd olika separationstekniker för att analysera de genererade produkterna31. Även om den kolorimetriska analysen som beskrivs här tydligt inte kan ge jämförbar information om glykogenens fina struktur, ger den ett enkelt och snabbt mått på mer eller mindre förgrening. Dessutom innehåller de erhållna spektra viss ytterligare information. Till exempel, som diskuteras under Representativa resultat, är prover av glykogen vanligtvis närvarande med absorbanstoppar vid ~ 400 nm och ~ 460 nm. Toppen vid ~ 400 nm representerar tydligen korta yttre kedjor i glykogenpartiklar, eftersom den förbättras i glykogen isolerad från jästmutanter som saknar förgreningsenzym i förhållande till vildjäst32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Det finns inga kända intressekonflikter förknippade med detta arbete och det har inte funnits något ekonomiskt stöd för detta arbete som kunde ha påverkat dess resultat.

Acknowledgments

Författaren vill tacka Karoline Dittmer och Andrew Brittingham för deras insikter och många hjälpsamma diskussioner. Detta arbete stöddes delvis av bidrag från Iowa Osteopathic Education and Research Fund (IOER 03-17-05 och 03-20-04).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylopectin (amylose free) from waxy corn Fisher Scientific A0456
Amylose Biosynth Carbosynth YA10257
ATP, disodium salt MilliporeSigma A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt MilliporeSigma G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt MilliporeSigma G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast MilliporeSigma 10127655001
Glycogen, Type II from oyster MilliporeSigma G8751
Hexokinase MilliporeSigma 11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL Fisher Scientific 14-955-128 Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt MilliporeSigma N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt MilliporeSigma 43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase MilliporeSigma N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt MilliporeSigma P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle MilliporeSigma P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle MilliporeSigma P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle MilliporeSigma P0294
UDP-glucose, disodium salt MilliporeSigma U4625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilson, W. A., et al. Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).
  2. Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists. Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).
  3. Roach, P. J. Glycogen and its metabolism. Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).
  4. Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose. Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).
  5. Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase. Biochemistry. 15 (4), 849-857 (1976).
  6. Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases. Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).
  7. Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).
  8. Nelson, T. E., Larner, J. A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase. Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).
  9. Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose. Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).
  10. Danforth, W. H. Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis. Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).
  11. Wayllace, N. Z., et al. An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases. Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).
  12. Shapiro, B., Wertheimer, E. Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues. Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).
  13. Mezl, V. A., Knox, W. E. Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates. Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).
  14. Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney. Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).
  15. Schreiber, W. E., Bowling, S. An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis. Annals of Clinical Biochemistry. 27, Pt 2 129-132 (1990).
  16. Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase. Biochemistry. 8 (4), 1419-1428 (1969).
  17. Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role. European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).
  18. Makino, Y., Omichi, K. Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).
  19. Lee, E. Y. C., Whelan, W. J. The Enzymes Vol. 5. Boyer, P. D. , Academic Press. 191-234 (1971).
  20. Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. The complex of amylose and iodine. Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).
  21. Boyer, C., Preiss, J. Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase. Biochemistry. 16 (16), 3693-3699 (1977).
  22. Krisman, C. R. A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine. Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).
  23. Friedman, D. L., Larner, J. Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence. Biochemistry. 2, 669-675 (1963).
  24. Hanashiro, I., Roach, P. J. Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate. Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).
  25. Huang, K. P., Cabib, E. Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties. Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).
  26. Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).
  27. Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).
  28. Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases. Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).
  29. Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family. Biochimie. 138, 90-101 (2017).
  30. Krisman, C. R. alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver. Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).
  31. Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. The fine structure of oyster glucogen. Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).
  32. Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis. Biochimie. 186, 59-72 (2021).

Tags

Biokemi utgåva 174
Spektrofotometriska metoder för studier av eukaryot glykogenmetabolism
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilson, W. A. Spectrophotometric… More

Wilson, W. A. Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism. J. Vis. Exp. (174), e63046, doi:10.3791/63046 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter