תרבית והדמיה של אורגנואידים אפיתל האף האנושיים
Summary
פרוטוקול מפורט מוצג כאן כדי לתאר מודל אורגנואידי במבחנה מתאי אפיתל האף האנושיים. בפרוטוקול יש אפשרויות למדידות הדורשות ציוד מעבדה סטנדרטי, עם אפשרויות נוספות לציוד ותוכנה מיוחדים.
Abstract
ניתן להשיג טיפול מותאם אישית לחולי סיסטיק פיברוזיס (CF) באמצעות מודל מחלה במבחנה כדי להבין את פעילות ווסת ההולכה הבסיסית של סיסטיק פיברוזיס טרנס-ממברנה (CFTR) ושיקום מתרכובות מולקולות קטנות. הקבוצה שלנו התמקדה לאחרונה בהקמת מודל אורגנואידי ממוין היטב שמקורו ישירות בתאי אפיתל האף האנושיים העיקריים (HNE). היסטולוגיה של אורגנואידים מחוטרים, צביעה אימונופלואורסצנטית בהרכבה מלאה והדמיה (באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית ושדה בהיר) חיוניים לאפיון אורגנואידים ולאישור התמיינות אפיתל בהכנה לבדיקות תפקודיות. יתר על כן, אורגנואידים של HNE מייצרים לומן בגדלים שונים המתואמים עם פעילות CFTR, ומבחינים בין אורגנואידים של CF לבין אורגנואידים שאינם CF. בכתב יד זה מתוארת בפירוט המתודולוגיה לגידול אורגנואידים מסוג HNE, תוך התמקדות בהערכת ההבחנה באמצעות שיטות ההדמיה, כולל מדידת אזור לומן בסיסי (שיטה למדידת פעילות CFTR באורגנואידים שכל מעבדה עם מיקרוסקופ יכולה להשתמש בה) וכן הגישה האוטומטית שפותחה לבדיקה פונקציונלית (הדורשת ציוד מיוחד יותר).
Introduction
מבוא לטכניקה
מבחנים מבוססי תרבות Ex vivo הם כלי המשמש יותר ויותר לרפואה מדויקת ולחקר פתופיזיולוגיה של מחלות. תרבית תאים ראשונית של אפיתל האף האנושי (HNE) שימשה במחקרים רבים של סיסטיק פיברוזיס 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 מחלה אוטוזומלית רצסיבית המשפיעה על תפקוד תאי האפיתל במספר איברים., תרבית HNE מספקת מקור מתחדש של אפיתליה של דרכי הנשימה שניתן להשיג באופן פרוספקטיבי ומשחזרת תכונות אלקטרופיזיולוגיות וביוכימיות לבדיקת פעילות ויסות ההולכה של סיסטיק פיברוזיס טרנס-ממברנה (CFTR). ניתן לדגום תאי HNE עם תופעות לוואי מינימליות14, בדומה למטושים נשימתיים נגיפיים נפוצים. עבודת מחקר המתארת מודל למחקר סיסטיק פיברוזיס שמקורו בביופסיות מברשת HNE פורסמה לאחרונה11,13. בעוד שבדומה למודלים אחרים המשתמשים ב- HNE 2,3 ראשוני ורקמת מעיים 15,16,17,18,19, אפיון מפורט של ההבחנה וההדמיה של מודל זה מתוארים כאן לשימוש במחקרי CF ולסיוע במחקרים של מחלות אחרות בדרכי הנשימה 13 . המודל האורגנואידי אינו בלתי מוגבל כמו קווי תאים מונצחים, אך ניתן להרחיבו על ידי תכנות מחדש מותנה (באמצעות פיברובלסטים מזינים מוקרנים ומומתקים ומעכבי Rho-kinase) למצב דמוי תאי גזע יותר 20,21,22,23. העיבוד של ביופסיות מברשת HNE בשיטה זו מניב מספר רב של תאי אפיתל לשימוש ביישומים מרובים בתפוקה גבוהה יותר תוך שמירה על היכולת להתמיין באופן מלא. בעוד שפרוטוקול זה פותח באמצעות תאי הזנה, מתודולוגיות אחרות עשויות לשמש חוקרים המבקשים להימנע מטכנולוגיית תאי ההזנה14,24.
חשיבות הטכניקה לביולוגיה ריאתית
מחקר משמעותי הוקדש להבנת האופן שבו היעדר CFTR קבוע ומתפקד בקרום התא של תאי אפיתל גורם לתפקוד לקוי בריאות, לבלב, כבד, מעיים או רקמות אחרות. הובלת יוני אפיתל לא מתפקדת, במיוחד זו של כלוריד וביקרבונט, גורמת לירידה בנפח נוזלי הרירית של האפיתל ולשינויים בהפרשות הריריות, מה שמוביל לקיפאון וחסימה רירית. במחלות אחרות בדרכי הנשימה, כגון דיסקינזיה סילארית ראשונית, שינוי בתנועה סילארית פוגע בפינוי הריריות ומוביל לקיפאון ריריות ולחסימה25. לכן, המודל האורגנואידי הנוכחי של HNE פותח עבור יישומים שונים, בהתאם לתכנון הניסויי של החוקר ולמשאביו. זה כולל הדמיה של תאים חיים באמצעות כתמים של תאים חיים; קיבעון וחתך כדי לאפיין את המורפולוגיה; צביעת אימונופלואורסצנציה עם נוגדנים והדמיה קונפוקלית של הרכבה מלאה כדי למנוע שיבוש מבנים אינטראלומינליים; וטומוגרפיה של הדמיה בשדה בהיר וקוהרנטיות מיקרו-אופטית למדידות כמותיות של תדר פעימה צילארית והובלה רירית13. כדי להקל על ההתרחבות לחוקרים אחרים, ריאגנטים ואספקה זמינים מסחרית שימשו לגידול. פותחה בדיקה פונקציונלית שהשתמשה בטכניקות מיקרוסקופ נפוצות ובציוד מיוחד יותר. באופן כללי, בעוד שהמודל הנוכחי תוכנן להעריך את פעילות ה-CFTR בנקודת ההתחלה או בתגובה לטיפולים, ניתן ליישם את הטכניקות המתוארות בפרוטוקול זה על מחלות אחרות המערבות את תפקוד תאי האפיתל, במיוחד הובלת נוזל תאי אפיתל.
השוואה למתודולוגיות אחרות
לאחרונה התועלת של מודל אורגנואידי זה פותחה על ידי קורלציה בין תגובות אפנן CFTR במבחנה של אורגנואידים של חולים לבין התגובה הקלינית שלהם11. יש לציין כי כמו כן, הוכח כי המודל הנוכחי מקביל לתגובות זרם קצר חשמלי, תקן הזהב הנוכחי להערכת תפקוד CFTR, באותם חולים. זרם קצר חשמלי שונה מבדיקת הנפיחות מכיוון שהראשון מודד את פונקציית CFTR באמצעות הובלת יונים26. לעומת זאת, בדיקה זו מודדת אפקט במורד הזרם עם הובלת נוזלים, ומספקת מידע נוסף על הפונקציה הכוללת של CFTR 27,28,29,30,31,32. מדידות זרם קצר המשיכו להיות שיטה נפוצה ואמינה לקביעת פעילות תעלת CFTR כלוריד 1,33. בדיקות אלקטרופיזיולוגיות אלה דורשות ציוד מיוחד ויקר, דורשות פי כמה וכמה יותר תאים עבור כל שכפול ניסיוני מאשר הבדיקה האורגנואידית, אינן ניתנות לאוטומטיות בקלות, ואינן ניתנות להתאמה להרחבה עבור יישומי תפוקה גבוהים יותר. למודל אורגנואידי נוסף שמקורו באפיתליה של המעיים יש יתרונות נוספים 15,16,17,18, כגון יכולת שכפול מצוינת יותר, אך הוא אינו נגזר מרקמת דרכי הנשימה ואינו זמין באופן אוניברסלי. מברשות HNE מתקבלות עם מברשות ציטולוגיה זולות ללא צורך בהרגעה ובסיכון מינימלי. קבלת הצחצוח אינה דורשת קלינאית ויכולה להתבצע על ידי רכזי מחקר מיומנים וצוותי מחקר אחרים14. מודל האורגנואידים של HNE יכול להיות תרבית על ידי כל מעבדה עם יכולות תרבית תאים ראשוניות, וחלק מהיישומים יכולים להתבצע עם טכניקות מיקרוסקופיה סטנדרטיות. בסך הכל, יתרונות אלה מספקים גישה נוספת לטכנולוגיה להערכת תפקוד אפיתל דרכי הנשימה שאחרת עשוי להיות לא זמין למעבדות מסוימות. יתר על כן, ניתן להשתמש באורגנואידים של HNE כדי לחקור מצבי מחלה אחרים המשפיעים על דרכי הנשימה, כגון dyskinesia25 סילארי ראשוני או זיהום ויראלי, אשר אורגנואידים במעיים אינם יכולים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב יד זה מספק מתודולוגיות מפורטות להדמיה חיה וקבועה מקיפה של האורגנואידים של אפיתל דרכי הנשימה הנגזרות מביופסיית מברשת HNE. הוא מתאר מבחנים פונקציונליים שיכולים לקבוע פעילות CFTR אצל אדם. HNEs מספקים רקמה ראשונית זעיר פולשנית למגוון יישומים. טכניקות ההרחבה המוצעות כאן יכולות לשמש למידול מחל?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים תודה על תרומתם של כל המשתתפים שתרמו ביופסיות מברשת HNE לפיתוח פרוטוקול זה. אנו מודים ללטונה קרש ולצוות היחידה לחקר ילדים על תיאום גיוס מתנדבי המחקר ואיסוף הדגימות. אנו מודים ללילי דנג, ג’ונתן ביילי וסטיבן מקיי, מתאמנים לשעבר במעבדה שלנו, על הסיוע הטכני. אנו מודים לז’ונג ליו ולרוי ז’או על עזרתם הטכנית. סטיבן מ. רואו, מנהל מרכז המחקר CF ב- UAB, מספק מנהיגות ומשאבים, שבלעדיהם עבודה זו לא תהיה אפשרית. אנו רוצים גם להודות לשרה גואדיאנה בביוטק על הסיוע בהכשרת מכשירים, לרוברט גרבסקי על הסיוע במיקרוסקופיה קונפוקלית במתקן ההדמיה ברזולוציה גבוהה של UAB, ולדז’י וואנג על הסיוע ההיסטולוגי בליבת ההיסטולוגיה של UAB. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH.) מענק K23HL143167 (ל- JSG), מענק GUIMBE18A0-Q של קרן סיסטיק פיברוזיס (ל- JSG), מרכז גרגורי פלמינג ג’יימס סיסטיק פיברוזיס [מענקי NIH R35HL135816 ו- DK072482 ותוכנית המחקר והפיתוח של אוניברסיטת CFF בברמינגהאם (UAB) (Rowe19RO)], ומרכז UAB למדע קליני ותרגומי (NIH Grant UL1TR001417).
Materials
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
References
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues. Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).
- Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).
- Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Guimbellot, J. S., et al. Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport. JCI Insight. 2 (22), (2017).
- Liu, Z., et al. Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis. Genes (Basel). 11 (6), (2020).
- Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
- Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Okiyoneda, T., et al. Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function. Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
- Bove, P. F., et al. Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Scudieri, P., et al. Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
- Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3 (2017).
- Blouquit, S., et al. Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).
- Birket, S. E., et al. Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).
- Birket, S. E., et al. A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).
- Chu, K. K., et al. Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography. Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).
- Chu, K. K., et al. et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).
- Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
- Tuggle, K. L., et al. Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats. PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).
- McCravy, M. S., et al. Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations. European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).
- Mutyam, V., et al. Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).
- Corning Inc. . CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , (2013).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Biotek Instruments, Incorporated. . Lionheart FX Live Cell Imager Operator’s Manual. , (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Simmonds, N. J. Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis. Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).
- McGarry, M. E., et al. In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies. Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).
- Garratt, L. W., et al. Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis. Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).
