Een gedetailleerd protocol wordt hier gepresenteerd om een in vitro organoïde model van menselijke neusepitheelcellen te beschrijven. Het protocol heeft opties voor metingen die standaard laboratoriumapparatuur vereisen, met extra mogelijkheden voor gespecialiseerde apparatuur en software.
Geïndividualiseerde therapie voor patiënten met cystische fibrose (CF) kan worden bereikt met een in vitro ziektemodel om de baseline Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) activiteit en herstel van kleine molecuulverbindingen te begrijpen. Onze groep heeft zich onlangs gericht op het opzetten van een goed gedifferentieerd organoïdemodel dat rechtstreeks is afgeleid van primaire menselijke neusepitheelcellen (HNE). Histologie van gesneden organoïden, whole-mount immunofluorescente kleuring en beeldvorming (met behulp van confocale microscopie, immunofluorescente microscopie en helder veld) zijn essentieel om organoïden te karakteriseren en epitheliale differentiatie te bevestigen ter voorbereiding op functionele assays. Bovendien produceren HNE-organoïden lumen van verschillende grootte die correleren met CFTR-activiteit, waarbij onderscheid wordt gemaakt tussen CF- en niet-CF-organoïden. In dit manuscript wordt de methodologie voor het kweken van HNE-organoïden in detail beschreven, met de nadruk op de beoordeling van differentiatie met behulp van de beeldvormingsmodaliteiten, waaronder de meting van het lumengebied (een methode voor CFTR-activiteitsmeting in organoïden die elk laboratorium met een microscoop kan gebruiken) evenals de ontwikkelde geautomatiseerde benadering van een functionele test (die meer gespecialiseerde apparatuur vereist).
Inleiding tot de techniek
Ex vivo op cultuur gebaseerde assays zijn een steeds vaker gebruikt hulpmiddel voor precisiegeneeskunde en de studie van ziektepathofysiologie. Primaire humane neusepitheel (HNE) celcultuur is gebruikt in talrijke studies van cystische fibrose 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , een autosomaal recessieve ziekte die de epitheelcelfunctie in meerdere organen beïnvloedt. HNE-cultuur biedt een hernieuwbare bron van luchtwegepithelia die prospectief kan worden verkregen en vat elektrofysiologische en biochemische kwaliteiten samen om cystic fibrosis transmembraangeleidingsregulator (CFTR) -activiteit te testen. HNE-cellen kunnen worden bemonsterd met minimale bijwerkingen14, vergelijkbaar met gewone virale respiratoire swabs. Onderzoekswerk dat een model beschrijft voor cystische fibrosestudie afgeleid van HNE-borstelbiopten is onlangs gepubliceerd11,13. Vergelijkbaar met andere modellen met primair HNE 2,3 en darmweefsel 15,16,17,18,19, wordt hier gedetailleerde karakterisering van de differentiatie en beeldvorming van dit model beschreven voor gebruik in CF-onderzoek en voor hulp bij de studies van andere luchtwegaandoeningen 13 . Het organoïde model is niet onbeperkt zoals onsterfelijke cellijnen, maar kan worden uitgebreid door voorwaardelijke herprogrammering (met behulp van bestraalde en geïnactiveerde feeder fibroblasten en Rho-kinaseremmers) tot een meer stamcelachtige toestand 20,21,22,23. De verwerking van HNE-borstelbiopten met behulp van deze methode levert grote aantallen epitheelcellen op voor gebruik in meerdere toepassingen met een hogere doorvoer, terwijl het vermogen om volledig te differentiëren behouden blijft. Hoewel dit protocol is ontwikkeld met behulp van feedercellen, kunnen andere methodologieën worden gebruikt door onderzoekers die feederceltechnologie willen vermijden 14,24.
Belang van de techniek voor de longbiologie
Een belangrijke studie is gewijd aan het begrijpen hoe de afwezigheid van regelmatige, functionerende CFTR in het celmembraan van epitheelcellen resulteert in disfunctie in de longen, pancreas, lever, darm of andere weefsels. Disfunctioneel epitheelionentransport, met name dat van chloride en bicarbonaat, resulteert in een verminderd volume van de epitheliale voeringvloeistoffen en veranderingen in slijmafscheidingen, wat leidt tot slijmstasis en obstructie. Bij andere luchtwegaandoeningen, zoals primaire ciliaire dyskinesie, schaadt veranderde ciliaire beweging de mucociliaire klaring en leidt tot slijmstasis en obstructie25. Daarom is het huidige HNE-organoïdemodel ontwikkeld voor verschillende toepassingen, afhankelijk van het experimentele ontwerp en de middelen van de onderzoeker. Dit omvat live-cell imaging met behulp van live-cell vlekken; fixatie en sectie om de morfologie te karakteriseren; immunofluorescentiekleuring met antilichamen en confocale beeldvorming in de hele mount om verstoring van intraluminale structuren te voorkomen; en bright-field imaging en micro-optische coherentietomografie voor kwantitatieve metingen van ciliaire slagfrequentie en mucociliair transport13. Om uitbreiding naar andere onderzoekers te vergemakkelijken, werden commercieel beschikbare reagentia en benodigdheden gebruikt voor het kweken. Er werd een functionele test ontwikkeld die gebruik maakte van gangbare microscooptechnieken en meer gespecialiseerde apparatuur. Over het algemeen, terwijl het huidige model is ontworpen om CFTR-activiteit bij baseline of als reactie op therapeutica te beoordelen, kunnen de in dit protocol beschreven technieken worden toegepast op andere ziekten waarbij epitheelcelfunctie betrokken is, met name epitheelcelvloeistoftransport.
Vergelijking met andere methodologieën
Onlangs werd het nut van dit organoïdemodel ontwikkeld door in vitro CFTR-modulatorresponsen van organoïden van patiënten te correleren met hun klinische respons11. Met name is ook aangetoond dat het huidige model parallel liep met kortsluitstroomresponsen, de huidige gouden standaard voor het beoordelen van de CFTR-functie, bij dezelfde patiënten. Kortsluitstroom verschilt van de zwellingstest omdat de eerste de CFTR-functie meet via ionentransport26. Deze test meet daarentegen een meer stroomafwaarts effect met vloeistoftransport en geeft aanvullende informatie over de totale functie van CFTR 27,28,29,30,31,32. Kortsluitstroommetingen zijn nog steeds een veelgebruikte en betrouwbare methode voor het bepalen van cftr-chloridekanaalactiviteit 1,33. Deze elektrofysiologische assays vereisen gespecialiseerde, dure apparatuur, vereisen vele malen meer cellen voor elke experimentele replicatie dan de organoïde assay, kunnen niet gemakkelijk worden geautomatiseerd en zijn niet vatbaar voor opschaling voor toepassingen met een hogere doorvoer. Een ander organoïde model afgeleid van intestinale epithelia heeft extra voordelen 15,16,17,18, zoals een meer uitstekend replicerend vermogen, maar is niet afgeleid van een luchtwegweefsel en is ook niet universeel beschikbaar. HNE-borstels worden verkregen met goedkope cytologieborstels zonder de noodzaak van sedatie en met minimaal risico. Het krijgen van het poetsen vereist geen clinicus en kan worden uitgevoerd door getrainde onderzoekscoördinatoren en ander onderzoekspersoneel14. Het HNE-organoïdemodel kan worden gekweekt door elk laboratorium met primaire celkweekmogelijkheden en sommige toepassingen kunnen worden uitgevoerd met standaardmicroscopietechnieken. Al met al bieden deze voordelen extra toegang tot technologie voor het beoordelen van de luchtwegepitheelfunctie die anders misschien niet beschikbaar zou zijn voor sommige laboratoria. Bovendien kunnen HNE-organoïden worden gebruikt om andere ziektetoestanden te bestuderen die de luchtwegen beïnvloeden, zoals primaire ciliaire dyskinesie25 of virale infectie, die intestinale organoïden niet kunnen.
Dit manuscript biedt gedetailleerde methodologieën voor uitgebreide live en vaste beeldvorming van de luchtwegepitheelorganoïden afgeleid van HNE-borstelbiopsie. Het beschrijft functionele assays die cftr-activiteit in een individu kunnen bepalen. HNE’s bieden een minimaal invasief, primair weefsel voor een verscheidenheid aan toepassingen. De hier aangeboden expansietechnieken kunnen worden gebruikt voor het modelleren van luchtwegaandoeningen, waaronder organoïden. Organoïden kunnen worden gebruikt voor precisiethe…
The authors have nothing to disclose.
We zijn dankbaar voor de bijdragen van alle deelnemers die HNE-borstelbiopten hebben gedoneerd om dit protocol te ontwikkelen. We bedanken Latona Kersh en medewerkers van de Children’s Research Unit voor het coördineren van de werving van onderzoeksvrijwilligers en het verzamelen van monsters. We bedanken Lily Deng, Johnathan Bailey en Stephen Mackay, voormalige stagiaires in ons laboratorium, voor technische assistentie. We bedanken Zhong Liu en Rui Zhao voor hun technische hulp. Steven M. Rowe, directeur van het CF Research Center bij UAB, biedt leiderschap en middelen, zonder welke dit werk niet mogelijk zou zijn. We willen ook Sarah Guadiana van Biotek bedanken voor hulp bij instrumenttraining, Robert Grabski voor confocale microscopie-assistentie bij de UAB High-Resolution Imaging Facility en Dezhi Wang voor histologische hulp bij de UAB Histology Core. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH.) Grant K23HL143167 (aan JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (aan JSG), het Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 en DK072482 en het CFF University of Alabama at Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)], en het UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).
Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
Forskolin | Sigma | F6886 | |
IBMX | Sigma | I5879 | |
Expansion Media | |||
DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
Insulin | Sigma | I9278 | |
Adenine | Sigma | A2786 | |
Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
Antibiotic Media | |||
Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
Differentiation Media | |||
DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
Insulin | Sigma | I-9278 | |
Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
Transferrin | Sigma | T-0665 | |
Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
Primary antibodies | |||
Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
Secondary antibodies | |||
Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |