ヒト鼻上皮オルガノイドの培養とイメージング
Summary
ヒト鼻上皮細胞からの インビトロ オルガノイドモデルを記述するために、詳細なプロトコールがここに提示される。このプロトコルには、標準的な実験装置を必要とする測定用のオプションがあり、特殊な装置およびソフトウェア用の追加の可能性があります。
Abstract
嚢胞性線維症(CF)患者に対する個別化治療は、ベースラインの嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)活性および小分子化合物からの回復を理解するために 、in vitro 疾患モデルを用いて達成することができる。私たちのグループは最近、初代ヒト鼻上皮細胞(HNE)から直接誘導される高分化型オルガノイドモデルの確立に着目しました。切片化されたオルガノイドの組織学、ホールマウント免疫蛍光染色、およびイメージング(共焦点顕微鏡、免疫蛍光顕微鏡、および明視野を使用)は、オルガノイドを特徴付け、機能アッセイの準備において上皮分化を確認するために不可欠です。さらに、HNEオルガノイドは、CFTR活性と相関する様々なサイズのルーメンを産生し、CFオルガノイドと非CFオルガノイドを区別する。本稿では、HNEオルガノイドの培養方法論を詳細に説明し、ベースライン内腔領域の測定(顕微鏡を備えたどの研究室でも採用できるオルガノイドにおけるCFTR活性測定方法)や、機能アッセイへの自動アプローチ(より特殊な装置を必要とする)の開発など、イメージングモダリティを用いた分化の評価に焦点を当てている。
Introduction
テクニックの紹介
エクスビボ培養ベースのアッセイは、精密医療および疾患病態生理学の研究にますます利用されているツールです。初代ヒト鼻上皮(HNE)細胞培養は、嚢胞性線維症の多数の研究に用いられてきた1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、複数の臓器の上皮細胞機能に影響を与える常染色体劣性疾患。HNE培養は、前向きに得られる可能性のある気道上皮の再生可能な供給源を提供し、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター(CFTR)活性をテストするために電気生理学的および生化学的性質を反復する。HNE細胞は、一般的なウイルス呼吸スワブと同様に、最小限の副作用14でサンプリングすることができる。HNEブラシ生検に由来する嚢胞性線維症研究のモデルを記述する研究研究が最近発表された11、13。原発性HNE 2,3および腸組織15,16,17,18,19を用いた他のモデルと同様であるが、CF研究においての使用および他の気道疾患の研究を支援するために、このモデルの分化および画像化の詳細な特徴付けがここに記載されている13。.オルガノイドモデルは、不死化細胞株のように無制限ではないが、条件付きリプログラミング(照射および不活化されたフィーダー線維芽細胞およびRhoキナーゼ阻害剤を使用)によって、より幹細胞様の状態に拡張することができる20、21、22、23。この方法を用いたHNEブラシ生検の処理は、完全に分化する能力を維持しながら、より高いスループットで複数のアプリケーションで使用するための多数の上皮細胞を生じる。このプロトコルはフィーダー細胞を用いて開発されたが、フィーダー細胞技術を避けたい研究者によって他の方法論が使用される可能性がある14,24。
肺生物学におけるこの技術の重要性
上皮細胞の細胞膜に規則的で機能するCFTRがないと、肺、膵臓、肝臓、腸、または他の組織で機能不全が生じる方法を理解することに重要な研究が捧げられてきました。機能不全の上皮イオン輸送、特に塩化物および重炭酸塩の輸送は、上皮内層液の体積の減少および粘液分泌物の変化をもたらし、粘液の停滞および閉塞をもたらす。原発性毛様体ジスキネジアなどの他の気道疾患では、毛様体運動の変化は粘膜繊毛クリアランスを損ない、粘液の停滞および閉塞をもたらす25。したがって、現在のHNEオルガノイドモデルは、研究者の実験計画およびリソースに応じて、様々な用途のために開発されている。これには、生細胞染色を用いた生細胞イメージングが含まれます。形態を特徴付けるための固定および切片化;抗体による免疫蛍光染色および管腔内構造の破壊を避けるための全マウント共焦点イメージング;毛様体拍動頻度および粘膜繊毛輸送の定量的測定のための明視野画像化およびマイクロ光コヒーレンス断層撮影法13を含む。他の研究者への拡大を容易にするために、市販の試薬および供給品を培養に使用した。一般的な顕微鏡技術とより特殊な装置を使用した機能アッセイが開発されました。全体として、本モデルはベースライン時または治療薬に応答してCFTR活性を評価するように設計されているが、このプロトコールに記載される技術は、上皮細胞機能、特に上皮細胞液輸送を伴う他の疾患に適用することができる。
他の方法論との比較
最近、このオルガノイドモデルの有用性は、患者のオルガノイドのインビトロCFTRモジュレーター応答を臨床応答と相関させることによって開発された11。注目すべきことに、本モデルが、CFTR機能を評価するための現在のゴールドスタンダードである短絡電流応答を同じ患者において並列化していることも実証されている。短絡電流は、前者がイオン輸送26を介してCFTR機能を測定するので、膨潤アッセイと異なる。対照的に、このアッセイは、流体輸送によるより下流の効果を測定し、CFTR27、28、29、30、31、32の全体的な機能に関する追加情報を提供する。短絡電流測定は、CFTR塩化物チャネル活性1,33を決定するための一般的で信頼性の高い方法であり続けている。これらの電気生理学的アッセイは、特殊で高価な装置を必要とし、各実験複製にオルガノイドアッセイよりも何倍もの細胞を必要とし、容易に自動化することができず、より高いスループットアプリケーションのためのスケールアップには適していません。腸上皮に由来する別のオルガノイドモデルは、より優れた複製能力などのさらなる利点15、16、17、18を有するが、気道組織に由来するものではなく、普遍的に利用可能でもない。HNEブラッシングは、鎮静を必要とせず、最小限のリスクで安価な細胞診ブラシで得られる。ブラッシングを受けることは、臨床医を必要とせず、訓練を受けた研究コーディネーターおよび他の研究スタッフ14によって行うことができる。HNEオルガノイドモデルは、初代細胞培養能力を有する任意の実験室で培養することができ、アプリケーションのいくつかは標準的な顕微鏡技術で行うことができる。全体として、これらの利点は、他の方法では一部の研究室では利用できないかもしれない気道上皮機能を評価するための技術へのさらなるアクセスを提供する。さらに、HNEオルガノイドは、腸管オルガノイドでは不可能な原発性毛様体ジスキネジー25またはウイルス感染など、気道に影響を及ぼす他の疾患状態を研究するために利用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿は、HNEブラシ生検に由来する気道上皮オルガノイドの包括的なライブおよび固定画像化のための詳細な方法論を提供する。個体におけるCFTR活性を決定することができる機能的アッセイを記載する。HNEは、さまざまな用途に低侵襲の一次組織を提供します。ここで提供される拡張技術は、オルガノイドを含む気道疾患をモデル化するために使用することができる。オルガノイドは、精…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、このプロトコルを開発するためにHNEブラシ生検を寄贈したすべての参加者の貢献に感謝する。ラトナ・カーシュと児童研究ユニットのスタッフが、研究ボランティアの募集とサンプル収集を調整してくれたことに感謝します。リリー・デン、ジョナサン・ベイリー、スティーブン・マッケイ、元研究室研修生の技術支援に感謝します。Zhong LiuとRui Zhaoの技術的な支援に感謝します。UABのCF研究センターのディレクターであるスティーブン・M・ロウは、リーダーシップとリソースを提供していますが、それなしではこの作業は不可能です。また、機器トレーニングの支援をしてくれたBiotekのSarah Guadiana氏、UAB高解像度イメージング施設での共焦点顕微鏡検査支援にRobert Grabski氏、UAB組織学コアでの組織学的支援をしてくれたDezhi Wang氏にも感謝します。この研究は、国立衛生研究所(NIH)の支援を受けました。Grant K23HL143167 (to JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (to JSG), the Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 and DK072482 and the CFF University of Alabama at Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)]、および UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417)。
Materials
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
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