El presente protocolo describe la inyección de células de osteosarcoma intratibia para generar modelos de ratón con osteosarcoma ortotópico y lesiones de metástasis pulmonar.
El osteosarcoma es el cáncer de hueso primario más común en niños y adolescentes, con los pulmones como el sitio metastásico más común. La tasa de supervivencia a cinco años de los pacientes con osteosarcoma con metástasis pulmonar es inferior al 30%. Por lo tanto, la utilización de modelos de ratón que imitan el desarrollo del osteosarcoma en humanos es de gran importancia para comprender el mecanismo fundamental de la carcinogénesis del osteosarcoma y la metástasis pulmonar para desarrollar nuevas terapias. Aquí, se informan procedimientos detallados para generar los modelos primarios de osteosarcoma y metástasis pulmonar en ratones a través de la inyección intratibia de células de osteosarcoma. Combinados con el sistema de imágenes en vivo de bioluminiscencia o rayos X, estos modelos de ratón vivo se utilizan para monitorear y cuantificar el crecimiento y la metástasis del osteosarcoma. Para establecer este modelo, se cargó una matriz de membrana basal que contenía células de osteosarcoma en una jeringa de microvolumen y se inyectó en una tibia de cada ratón atímico después de ser anestesiada. Los ratones fueron sacrificados cuando el osteosarcoma primario alcanzó la limitación de tamaño en el protocolo aprobado por la IACUC. Se separaron las piernas con osteosarcoma y los pulmones con lesiones de metástasis. Estos modelos se caracterizan por un corto período de incubación, crecimiento rápido, lesiones graves y sensibilidad en el monitoreo del desarrollo de lesiones metastásicas primarias y pulmonares. Por lo tanto, estos son modelos ideales para explorar las funciones y mecanismos de factores específicos en la carcinogénesis del osteosarcoma y la metástasis pulmonar, el microambiente tumoral y evaluar la eficacia terapéutica in vivo.
El osteosarcoma es el cáncer óseo primario más frecuente en niños y adolescentes 1,2, que se infiltra principalmente en el tejido circundante, e incluso hace metástasis en los pulmones cuando se diagnostica a los pacientes. La metástasis pulmonar es el principal desafío para la terapia del osteosarcoma, y la tasa de supervivencia a cinco años de los pacientes con osteosarcoma con metástasis pulmonar sigue siendo tan baja como 20%-30%3,4,5. Sin embargo, la tasa de supervivencia a cinco años del osteosarcoma primario se ha incrementado a alrededor del 70% desde la década de 1970 debido a la introducción de la quimioterapia6. Por lo tanto, se necesita urgentemente comprender el mecanismo fundamental de la carcinogénesis del osteosarcoma y la metástasis pulmonar para desarrollar nuevas terapias. La aplicación de modelos de ratón que mejor imiten la progresión del osteosarcoma en humanos es de gran importancia7.
Los modelos animales de osteosarcoma se generan mediante ingeniería genética espontánea e inducida, trasplante y otras técnicas. El modelo de osteosarcoma espontáneo rara vez se utiliza debido al largo tiempo de formación del tumor, la tasa de ocurrencia de tumores inconsistentes, la baja morbilidad y la escasa estabilidad 8,9. Aunque el modelo de osteosarcoma inducido es más accesible de obtener que el osteosarcoma espontáneo, la aplicación del modelo de osteosarcoma inducido es limitada porque el factor inductor afectará el microambiente, la patogénesis y las características patológicas del osteosarcoma10. Los modelos transgénicos están ayudando a comprender la patogénesis de los cánceres, ya que pueden simular mejor los entornos fisiológicos y patológicos humanos; sin embargo, los modelos animales transgénicos también tienen sus limitaciones debido a la dificultad, el largo plazo y el alto costo de la modificación transgénica. Además, incluso en los modelos animales transgénicos más ampliamente aceptados generados por la modificación del gen p53 y Rb, solo el 13,6% del sarcoma ocurrió en los cuatro huesos de las extremidades11,12.
El trasplante es uno de los métodos de producción de modelos de cáncer metastásico primario y a distancia más utilizados en los últimos años debido a su maniobra simple, tasa de formación de tumores estable y mejor homogeneidad13. El trasplante incluye el trasplante heterotópico y el trasplante ortotópico según los sitios de trasplante. En el trasplante heterotópico de osteosarcoma, las células de osteosarcoma se inyectan fuera de los sitios primarios de osteosarcoma (hueso) de los animales, comúnmente debajo de la piel, por vía subcutánea14. Aunque el trasplante heterotópico es sencillo sin la necesidad de realizar cirugía en animales, los sitios donde se inyectan las células del osteosarcoma no representan el microambiente real del osteosarcoma humano. El trasplante ortotópico de osteosarcoma es cuando las células de osteosarcoma se inyectan en los huesos de los animales, como la tibia15,16. En comparación con los injertos heterotópicos, los injertos de osteosarcoma ortotópico se caracterizan por un período de incubación corto, un crecimiento rápido y una fuerte naturaleza erosiva; por lo tanto, son modelos animales ideales para estudios relacionados con el osteosarcoma17.
Los animales más utilizados son ratones, perros y peces cebra18,19. El modelo espontáneo de osteosarcoma se suele utilizar en caninos porque el osteosarcoma es uno de los tumores más comunes en caninos. Sin embargo, la aplicación de este modelo es limitada debido al largo tiempo de formación del tumor, la baja tasa de tumorigénesis, la escasa homogeneidad y la estabilidad. Los peces cebra se utilizan a menudo para construir modelos tumorales transgénicos o knockout debido a su rápida reproducción20. Pero los genes del pez cebra son diferentes de los genes humanos, por lo que sus aplicaciones son limitadas.
Este trabajo describe los procedimientos detallados, las precauciones y las imágenes representativas para producir el osteosarcoma primario en la tibia con metástasis pulmonar a través de la inyección intratibia de células de osteosarcoma en ratones atímicos. Este método se aplicó para crear el osteosarcoma primario en tibia de ratón para evaluación de eficacia terapéutica, que mostró una alta reproducibilidad21,22.
La inyección ortotópica de células de osteosarcoma es un modelo ideal para estudiar la función y el mecanismo de factores específicos en la carcinogénesis y el desarrollo del osteosarcoma para evaluar la eficacia terapéutica. Para evitar diferencias en el crecimiento tumoral, la mayoría de las células activas de osteosarcoma al 80% -90% confluentes con el mismo número se inyectan cuidadosamente en la tibia de cada ratón, y el tiempo de tripsinización celular se controla estrictamente sin afectar la viabilidad…
The authors have nothing to disclose.
Este estudio fue apoyado por subvenciones de (1) El Programa Nacional Clave de I + D de China (2018YFC1704300 y 2020YFE0201600), (2) la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza (81973877 y 82174408).
Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |