Live-3D-cel immunocytochemie Assays van pediatrische diffuse middellijn glioom
Summary
Deze studie presenteert een protocol van live-3D-cel immunocytochemie toegepast op een pediatrische diffuse midline glioom cellijnlijn, nuttig om in real-time de expressie van eiwitten op het plasmamembraan te bestuderen tijdens dynamische processen zoals 3D-celinvasie en migratie.
Abstract
Celmigratie en invasie zijn specifieke kenmerken van Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutante tumoren. We hebben deze functies al gemodelleerd met behulp van driedimensionale (3D) celgebaseerde invasie- en migratietests. In deze studie hebben we deze 3D-assays geoptimaliseerd voor live-cell immunocytochemie. Een antilichaamlabelreagens werd gebruikt om in realtime de expressie van het adhesiemolecuul CD44 te detecteren, op het plasmamembraan van migrerende en binnendringende cellen van een DMG H3K27M primaire patiënt-afgeleide cellijn. CD44 is geassocieerd met kankerstamcelfenotype en tumorcelmigratie en -invasie en is betrokken bij de directe interacties met de extracellulaire matrix van het centrale zenuwstelsel (CZS). Neurosferen (NS) uit de DMG H3K27M-cellijn werden ingebed in de basale membraanmatrix (BMM) of geplaatst op een dunne coatinglaag van BMM, in aanwezigheid van een anti-CD44-antilichaam in combinatie met het antilichaametiketteringsreagens (ALR). De live-3D-cell immunocytochemische beeldanalyse werd uitgevoerd op een live-cell analyse-instrument om de totale CD44-expressie kwantitatief te meten, specifiek op de migrerende en binnendringende cellen. De methode maakt het ook mogelijk om in real-time de intermitterende expressie van CD44 op het plasmamembraan van migrerende en binnendringende cellen te visualiseren. Bovendien leverde de test ook nieuwe inzichten op in de potentiële rol van CD44 in de mesenchymale naar amoeboïde overgang in DMG H3K27M-cellen.
Introduction
Het vermogen van tumorcellen om te ontwijken en zich te verspreiden door het omliggende weefsel is een kenmerk van kanker1. In het bijzonder is tumorcelmotiliteit een kenmerkend kenmerk van kwaadaardige tumoren, of het nu gaat om een gemetastaseerd tumortype zoals borst2 of colorectale kanker3 of een lokaal invasief type zoals diffuus glioom 4,5.
Beeldvorming speelt een centrale rol in het onderzoek naar vele aspecten van tumorcelfenotypen; Live-cell imaging heeft echter zeker de voorkeur bij het bestuderen van dynamische cellulaire processen zoals migratie en invasie, wanneer veranderingen in morfologie en cel-celinteractie 6,7 optreden en in de loop van de tijd gemakkelijker kunnen worden onderzocht. Voor live-cell imaging kunnen verschillende optische microscopiesystemen worden gebruikt, van fasecontrast tot confocale fluorescerende microscopen, en beeldacquisitie uitgevoerd over een korte of lange periode op een omgekeerde microscoop uitgerust met een kamer voor temperatuur- en CO2-regeling, of in high-content beeldanalysesystemen met ingebouwde kamers, of als alternatief in beeldsystemen die in de incubator kunnen zitten zonder de cellen gedurende de hele duur te hoeven verstoren van het experiment. De keuze van het gebruikte systeem wordt vaak bepaald door een aantal factoren, zoals de benodigde resolutie, de lengte van de totale acquisitietijd en tijdsintervallen, het gebruikte vattype en de doorvoer van de test (enkele kamer of multi-well plaat), de gevoeligheid van de gebruikte cellen (kostbare en / of zeldzame cellen) en fototoxiciteit van de cellen als fluoroforen aanwezig zijn.
Met betrekking tot fluorescerende beeldvorming in live-modus kan dit worden bereikt door cellen te transduceren voor de expressie van fluorescerende eiwitten, hetzij voor stabiele expressie of als een induceerbaar systeem8, door transiënte celtransfectie, of door celkleurstoffen te gebruiken die nu beschikbaar zijn voor live-cell labeling7, voor live-cell tracking en voor het labelen van subcellulaire organellen9.
Een nuttige benadering is onlangs ontwikkeld voor live-cell immunocytochemie, waarbij een antilichaam dat een oppervlaktemarker naar keuze herkent, kan worden gebonden aan een etiketteringsreagens, en na toevoeging aan de kweekmedia kunnen cellen die de specifieke marker tot expressie brengen gemakkelijk in realtime worden afgebeeld door live-cell imaging. De visualisatie en kwantificering van markerexpressie met behulp van een dergelijk systeem kan gemakkelijk worden bereikt wanneer cellen worden gekweekt in tweedimensionale (2D) cultuuromstandigheden10.
In deze studie hebben we protocollen geoptimaliseerd voor live-3D-cel immunocytochemische invasie en migratie van pediatrische diffuse midline glioma (DMG) patiënt-afgeleide cellen11,12. DMG zijn zeer agressieve hersentumoren die kinderen treffen, voor de overgrote meerderheid geassocieerd met de drivermutatie K27M in histon H3-varianten. DMG ontstaat in de hersenstam en de middellijngebieden van het centrale zenuwstelsel (CZS) en wordt gekenmerkt door een zeer infiltratief karakter. Van deze invasieve capaciteit is aangetoond dat deze ten minste gedeeltelijk wordt gemedieerd door de intratumor heterogeniteit en de kankerstamachtige kenmerken van DMG-cellen7.
Om onze testen te illustreren, werd een antilichaamlabelreagens (ALR) gebruikt in combinatie met een antilichaam voor CD44. CD44 is een transmembraan glycoproteïne en adhesiemolecuul uitgedrukt op stamcel- en andere celtypen, geassocieerd met kankerstamcelfenotype en tumorcelmigratie en invasie13. De protocollen omvatten de monstervoorbereiding, de beeldacquisitie in brightfield- en fluorescerende modus en de analyse op een live-cell analyse-instrument dat het mogelijk maakte om kwantitatief in realtime de algehele CD44-expressie op het DMG-celmembraan te meten tijdens 3D-invasie en migratie. De testen maakten het ook mogelijk om het intermitterende fluorescerende signaal van CD44 op individuele cellen te visualiseren tijdens het migreren en binnendringen. Interessant is dat ook een effect van het anti-CD44-antilichaam werd waargenomen, dat mogelijk als een blokkerend antilichaam fungeerde, ook de celmigratie en invasie leek te verminderen en een omschakeling van het invasiepatroon van een collectief mesenchymaal-achtig naar een meer eencellig amoeboïde-achtig fenotype induceerde.
Protocol
Representative Results
Discussion
De live-3D-cel immunocytochemie die we hier hebben aangenomen voor pediatrische DMG-invasie en migratie kan gemakkelijk worden aangepast, ook voor andere zeer invasieve tumorceltypen, waaronder borst- en darmkankercellijnen.
Anders dan eerder uitgevoerde live-2D-cel immunocytochemie assays10, wordt bij het werken in 3D voorgesteld om aandacht te besteden aan enkele kritieke stappen. In het bijzonder wordt voor de invasietest die we beschrijven, geadviseerd om de ALR / …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Dr. Silvia Soddu en Dr. Giulia Federici (Unit of Cellular Networks and Molecular Therapeutic Targets, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Rome, Italië) bedanken voor de toegang tot het IncuCyte S3 Live Cell Imaging System in de voorlopige opzet van het beeldvormingsprotocol. Bovendien danken we Bernadett Kolozsvari voor het technische advies. De studie werd ondersteund door de Children with Cancer UK-beurs (16-234) en het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid Ricerca Corrente. M Vinci is een Children with Cancer UK Fellow. R Ferretti is een ontvanger van de Fondazione Veronesi Fellowship (2018 en 2019). De auteurs erkennen Fondazione Heal voor hun steun en de Children’s Hospital Foundation voor het financieren van de Queensland Children’s Tumor Bank.
Materials
| 96 Well TC-Treated Microplates | Corning | 3595 | size 96 wells, polystyrene plate, flat bottom |
| Accutase | Euroclone | ECB3056D | solution for neurosphere dissociation |
| Burker chamber | Mv medical | FFL16034 | cell counting chamber |
| CD-44 (156-3C11) | Cell Signaling Technology | 3570 | Mouse mAb IgG2a |
| Corning Matrigel Matrix | Corning | 356237 | Basement Membrane Matrix (BMM), Phenol Red-free, LDEV-free |
| Fabfluor-488 Antibody Labeling Dye | Incucyte | 4743 | Antibody labelling reagent (ALR): Mouse IgG2a 488 antibody for Live-Cell Immunocytochemistry |
| Incucyte S3 and/or SX5 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | – | The Incucyte S3 and/or SX5 Instrument is used for real-time cell monitoring and surveillance, cell health and viability, migration and invasion, plus a wide range of phenotypic cell-based assays. |
| Inverted Microscope | – | any inverted microscope | |
| Opti-Green Background Suppressor Reagent | Incucyte | 6500-0045 | Backgroung suppressor reagent (BSR) |
| Tumor stem cell (TSM) medium | – | – | growth cell medium (see reference in the text for details) |
| Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Corning Costar | 7007 | size 96 well, round bottom clear |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
- Magrì, A., Bardelli, A. Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Caretti, V., et al. Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma. Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).
- Pericoli, G., et al. Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763 (2020).
- Vinci, M., et al. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).
- Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies. Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).
- Huang, C. C., et al. Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells. PLoS One. 10 (6), 0128045 (2015).
- Prudner, B. C., et al. Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors. Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).
- Ferretti, R., et al. Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction. Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64 (2018).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).
- Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).
- Mount, C. W., et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M. Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Czabanka, M., et al. Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209 (2020).
- Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
- Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
