用于分析细胞信号的集成工具包 (iTACS) 平台可自动测量贴壁细胞中的各种化学和机械信号。iTACS旨在促进社区驱动的开发,并使研究人员能够使用所有平台功能,无论其教育背景如何。
在过去四十年中,对细胞力和运动的定量评估有了相当大的进步。这些进步为检查细胞培养系统中富有洞察力的机械信号传导过程提供了框架。然而,该领域目前面临三个问题:获取数据缺乏质量标准化,数据分析和可视化中的技术错误,也许最重要的是,该技术对于普通的细胞生物学实验室来说仍然遥不可及。为了克服这些限制,我们开发了一个新的实验平台 – 分析蜂窝信号的集成工具包(iTACS)。iTACS由两个组件组成:采集和训练模块(AcTrM)以及分析和可视化模块(AnViM)。AcTrM基于μManager(一种基于NIH-ImageJ的显微镜控制软件),有助于用户进行自我培训和自动化常用图像采集协议。AnViM基于NIH-ImageJ,有助于用户友好的数据分析自动化和结果的有见地可视化。这些实验涉及在水凝胶上培养贴壁细胞,对嵌入水凝胶中的基准标记物进行成像,最后从这些图像中提取细胞的全面机械表征。目前,iTACS使用户能够分析和跟踪各种特性,包括形态学,运动,细胞骨架力以及单个细胞及其邻近区域的荧光。质量标准化问题在AcTrM中得到了解决,这是一种参考图像引导的重新对焦技术。AnViM通过多管齐下的图像分割程序,用户友好的边界条件识别方法以及基于蜂窝属性的新型数据可视化解决了数据分析中的技术问题。AcTrM旨在促进基本荧光显微镜直接转换为实验细胞力学装置,而AnViM的配备使用户无需工程背景即可测量细胞机械信号。iTACS将作为具有社区驱动开发能力的开源套件提供给研究社区。
常用的光学成像和数据分析工具采用的硬件和软件技术几乎过时。电子设备,计算方法和数学分析的进步在常见实验细胞生物学工具中的翻译和实施滞后是对我们细胞生理学知识增长速度的主要制约因素。目前,细胞生物学研究人员发现分子生物学工具触手可及,但基于工程原理的工具遥不可及。一个基于工程原理的工具是单层应力显微镜(MSM)1,2。虽然MSM已在全球各种实验室中进行了改编和研究,但其使用主要限于具有工程专业知识的实验室3,4,5,6,7,8,9。
NIH-ImageJ是细胞生物学研究人员中最受欢迎的开源工具之一10。用户社区贡献驱动的进步是其受欢迎程度的核心11,12。ImageJ具有允许用户使用高级编程语言和简化脚本方法开发应用程序的功能。这些功能有助于具有基本编程知识的用户实现,适应和推进对软件的任何新贡献。基于NIH-ImageJ的这些特性,我们开发了分析细胞信号的集成工具包(iTACS),该工具包能够以低成本集成所需的硬件和软件工具,以自动测量贴壁细胞中的各种化学和机械信号11,12。
iTACS由两个组件组成:采集和训练模块(AcTrM)以及分析和可视化模块(AnViM)。AcTrM基于μManager(一种基于NIH-ImageJ的图像采集应用程序)构建,使用户能够设置多个样品中贴壁细胞的传统光学特性和各种物理特性的延时测量12。AcTrM 通过图形界面中包含的简明说明方便用户培训。此外,它还具有基于参考图像的自动对焦的新颖功能,旨在促进物理力的实时测量,并使采集的数据的质量标准化。
AnViM基于ImageJ插件,加急软件和文件处理脚本构建,使用户能够定量评估50多种属性,包括细胞形状,大小,方向,运动速度和方向,对细胞外基质(ECM)施加的牵引力,以及对相邻细胞,单个贴壁细胞及其邻近区域的收缩和剪切矩。AnViM有助于用户量化细胞物理特性,而无需掌握底层技术背景11。此外,它还支持在交互式或批处理模式下进行数据分析。它生成显示空间变化的热图和显示单个细胞属性的时间变化的图形。
在典型的实验中,用户在弹性水凝胶上培养细胞,顶部表面有适当的细胞外基质蛋白和两种类型的嵌入荧光标记物。从本质上讲,在培养细胞之前和之后这些荧光标记物的图像足以量化单个细胞内和周围的力2,13。AnViM将这些结果映射到贴壁簇的单个细胞上,并生成有见地的图像和图表。
贴壁细胞使用机械和化学信号来生存,生长和功能。各种各样的显微镜软件通过基于荧光的成像优化了评估化学信号的用户体验。然而,机械信号的评估涉及标准显微镜软件中没有的功能。此外,当数据采集与数据分析相结合时,机械信号的评估效率最高。缺乏满足机械信号评估独特需求的统一平台一直是实验细胞生物学中的主要技术差距。用于分析蜂窝信号的集成工具包(iTACS)旨在满足这一差距。iTACS的两个组成部分,AnViM和AcTrM,为用户提供了必要的功能来量化四大类的细胞特性:力,运动,形态和荧光/亮度。在这些类别中,iTACS目前能够揭示单个贴壁细胞的50多个独特方面。这些方面包括每个广泛类别的特定性质,包括它们在细胞中的代表性值和变异性(补充表S1)。例如,在力内,细胞骨架上有拉伸力,这种张力的各向异性,最大张力的方向以及穿过细胞-ECM界面的剪切应力,这对贴壁细胞的行为有深远的影响1,3,6。
一种检查单层单个细胞机械行为的新方法
单层的单个细胞参与化学和机械性质的信号交换3。这两种类型的信号以不同的方式在蜂窝单层上传输23。然而,机械信号传输知识落后于化学信号传输。这种知识差距与持续缺乏简单直观的方法来评估细胞机械信号相吻合。这里描述的新颖数据映射方法足以填补这一空白。这种映射表明,细胞邻近区域内在细胞骨架张力的波动可作为弛豫,流态化和锚定信号,调节细胞形状,大小和细胞速度的变化18。邻近区域的属性图表现出”多细胞细分”模式,其中细分内的细胞暴露在相对均匀的微环境中,而细分边界的细胞暴露在非常不均匀的微环境中18。
力测量技术的可访问性
存在多种方案来制造PAA水凝胶,分析水凝胶变形和细胞运动,并量化细胞 – ECM和细胞 – 细胞力1,2,7,8,9,13,14,15,18,20,21,24,25,26,27,28,29,30,31,32.然而,这些发展仍然超出了普通细胞生物学实验室的范围,并且仅限于具有工程专业知识的实验室。通过自动化这些方法的技术方面,并将它们集成到一个统一且用户友好的平台下,iTACS的目标是使机械信号的评估成为实验细胞生物学研究和教育中的常规活动。
ImageJ 允许用户使用几乎不需要培训的方法开发应用程序11。iTACS 主要使用简单的脚本编写方法构建,以促进社区驱动的持续开发。大部分 AcTrM 使用 BeanShell 脚本进行编程,大部分 AnViM 使用 ImageJ 宏进行编程。这些脚本和在用户显微镜上实现这些功能的指南可通过 GitHub(https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS)获得。
采集图像的质量标准化
尽管基于弹性底物的量化贴壁细胞物理力的技术已经在各种实验室中开发和实施,但该协议仍然缺乏标准化。最需要标准化的一个领域是采集的顶部珠子图像的质量(补充图S1)。在整个实验过程中,焦点漂移会产生重大问题。我们新颖的基于参考图像的重新聚焦方法使这种聚焦成为一个客观的过程。AcTrM 第一步中定义的参数施加了必要的客观质量限制。其他标准化措施可以在未来版本的 AcTrM 中编程。
iTACS的广泛适用性
除了量化贴壁细胞的许多方面外,iTACS结构还有助于其用于各种实验方案和需求。AcTrM 允许软件引导的用户自我培训。例如,同时评估细胞质钙波动所需的高速成像目前受到重新定位和重新聚焦硬件速度的限制,最好一次在一个位置完成。然而,目前的实现对于长期成像,中断成像具有良好的条件,其中样品在整个实验过程中不能保留在显微镜载物台上。由于参考图像是在实验开始时采集的,因此iTACS能够对机械信号进行实时成像,从而为药物筛选应用开辟了新的途径。AnViM允许用户以外行术语提供高度技术性的信息。量化广泛的细胞特性并在整个实验过程中跟踪它们的能力构成了发现新的细胞间通信机制所需的关键能力。
对于iTACS的未来发展,我们确定了四个重点领域:(1)提高数据采集和数据分析速度,(2)实施评估新蜂窝信号的方法13,(3)开发基于iTACS的蜂窝信号评估的研讨会和教育模块,(4)开发低成本自动化解决方案。
The authors have nothing to disclose.
D.T.T.感谢南阿拉巴马大学肺生物学中心附属的工作人员激发了关于实验细胞生物学研究需求的讨论。这些讨论对于启动iTACS的发展至关重要。
这项工作得到了美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所P01 HL66299和R37 HL60024(史蒂文斯),R01-HL118334(Alvarez),F32-HL144040-01(Xu)以及南阿拉巴马大学通过亚伯拉罕米切尔癌症研究基金(Singh,Palanki,Tambe),研究和学术发展补助金(Tambe),荣誉学院和暑期本科生研究员(Nguyen)的部分资助。
Reagents and components used in prepare glass surface for hydrogel coating | |||
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 97% | Aldrich chemistry | 13822565 | |
2% Bis Solution | Bio-rad | 1610142 | |
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate,98% | Acros organics | 2530850 | |
40% Acrylamide Solution | Bio-rad | 1610140 | |
Glass bottom 35 mm dish/ 6 or 12 or 24 well plates | MatTek or CellVis | ||
Glutaraldehyde, EM Grade, 25% | Polysciences | 1909100 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-aldrich | 1002074706 | |
Reagents and components used in preparing suitable hydrogel | |||
2% Bis Solution | Bio-rad | 1610142 | |
40% Acrylamide Solution | Bio-rad | 1610140 | |
Ammonium Persulfate | Bio-rad | 1610700 | |
Cover Slips | Electron Microscopy Sciences | 7222301 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1M) | Gibco | 14190136 | |
FluoSpheres carboxylate 0.2 um, yellow-green(505/515) | Invitrogen | F8811 | |
FluoSpheres carboxylate 0.5 um, red(580/605) | Invitrogen | F8812 | |
FluoSpheres carboxylate 2.0 um, red(580/605) | Invitrogen | F8826 | |
Rain-X | |||
TEMED | Bio-rad | 1610801 | |
Reagents used in coating extracellular matrix on the hydrogel | |||
Collagen Type I Rat Tail | Corning | 354236 | |
HEPES(1M) | Gibco | 15630080 | |
Phosphate Buffered Saline (1M) | Gibco | 10010023 | |
Sulfo-SANPAH | CovaChem | 102568434 | |
Microscope hardware used in the current study | |||
Camera | Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera | C11440-42U | |
H117 ProScanTM Stages | Prior Scientific | ||
Light source- Lambda DG4 and Lambda DG5 | Sutter instrument company | ||
Microscope | Nikon eclipse TE2000-S | 550372 | |
ProScan III Universal Microscope Automation Controller | Prior Scientific | ||
Stagetop incubator | ibidi | 11922 | |
Stepper Motor Focus Drive | Prior Scientific |