La fabrication et l’exploitation d’un système de micro-électroporation à flux continu avec détection de perméabilisation

Summary

Ce protocole décrit les techniques de microfabrication requises pour construire un dispositif d’électroporation microfluidique en laboratoire sur puce. La configuration expérimentale effectue des transfections contrôlées au niveau d’une seule cellule dans un flux continu et peut être étendue à des débits plus élevés avec un contrôle basé sur la population. Une analyse est fournie démontrant la capacité de surveiller électriquement le degré de perméabilisation de la membrane cellulaire en temps réel.

Abstract

Les innovations thérapeutiques actuelles, telles que la thérapie cellulaire CAR-T, dépendent fortement de l’administration de gènes à médiation virale. Bien qu’efficace, cette technique s’accompagne de coûts de fabrication élevés, ce qui a suscité un intérêt pour l’utilisation de méthodes alternatives pour l’administration de gènes. L’électroporation est une approche électrophysique non virale pour la livraison intracellulaire de gènes et d’autres matériaux exogènes. Lors de l’application d’un champ électrique, la membrane cellulaire permet temporairement la livraison moléculaire dans la cellule. En règle générale, l’électroporation est effectuée à l’échelle macroscopique pour traiter un grand nombre de cellules. Cependant, cette approche nécessite un développement de protocole empirique approfondi, ce qui est coûteux lorsque l’on travaille avec des types de cellules primaires et difficiles à transfecter. Le développement de longs protocoles, associé à l’exigence de grandes tensions pour atteindre des intensités de champ électrique suffisantes pour perméabiliser les cellules, a conduit au développement de dispositifs d’électroporation à micro-échelle. Ces dispositifs de micro-électroporation sont fabriqués à l’aide de techniques de microfabrication courantes et permettent un plus grand contrôle expérimental avec le potentiel de maintenir des capacités de débit élevé. Ce travail s’appuie sur une technologie d’électroporation microfluidique capable de détecter le niveau de perméabilisation de la membrane cellulaire au niveau d’une seule cellule en flux continu. Cependant, cette technologie a été limitée à 4 cellules traitées par seconde, et donc une nouvelle approche pour augmenter le débit du système est proposée et présentée ici. Cette nouvelle technique, appelée contrôle par rétroaction basé sur la population cellulaire, considère la réponse de perméabilisation cellulaire à une variété de conditions de pulsations d’électroporation et détermine les conditions d’impulsion d’électroporation les mieux adaptées au type de cellule testé. Un mode à débit plus élevé est ensuite utilisé, où cette impulsion « optimale » est appliquée à la suspension cellulaire en transit. Les étapes de fabrication de l’appareil, de mise en place et d’exécution des expériences microfluidiques et d’analyse des résultats sont présentées en détail. Enfin, cette technologie de micro-électroporation est démontrée en délivrant un plasmide d’ADN codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) dans les cellules HEK293.

Introduction

Les innovations thérapeutiques actuelles dans la recherche biomédicale, telles que la thérapie cellulaire CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T cell) et l’édition génétique utilisant CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeat DNA sequences)/Cas9, reposent fortement sur la capacité de délivrer du matériel exogène à la fois avec succès et efficacité dans l’espace intracellulaire¹. Dans la thérapie CAR-T, l’étalon-or pour effectuer l’étape de livraison de gènes dans la fabrication de thérapies cellulaires est l’utilisation de vecteurs viraux². Bien que l’administration de gènes à médiation virale soit une modalité de livraison efficace, elle présente également plusieurs inconvénients. Il s’agit notamment des coûts de fabrication, de la cytotoxicité, de l’immunogénicité, du potentiel de mutagénèse/tumorigenèse et des limites de taille du ou des gènes à administrer³. Ces limites ont mené à la recherche et au développement de technologies d’administration alternatives et non virales.

L’électroporation, une alternative à la livraison de gènes à médiation virale, repose sur l’application d’une forme d’onde d’impulsion électrique optimale pour effectuer des transfections d’ADN, d’ARN et de protéines des cellules. Après l’application d’un champ électrique externe, la membrane cellulaire est brièvement compromise, ce qui rend la cellule sensible à la livraison intracellulaire de matériaux exogènes autrement imperméables⁴. Par rapport à l’accouchement à médiation virale, l’électroporation est avantageuse car elle est généralement sûre, facile à utiliser et a de faibles coûts d’exploitation. L’électroporation peut fournir à la fois une petite et une grande cargaison moléculaire et peut être efficace pour transfecter les cellules, quelle que soit la lignée⁵. Pour obtenir les résultats souhaités après l’électroporation, c’est-à-dire une bonne viabilité et une bonne efficacité d’électrotransfection, divers paramètres expérimentaux doivent être co-optimisés. Il s’agit notamment du type de cellule 6, de la densité cellulaire, de la concentration de molécules⁷, des propriétés tampons d’électroporation (p. ex. composition moléculaire, conductivité et osmolarité)⁸, de la taille/géométrie de l’électrode⁹ et^de la forme d’onde des impulsions électriques (forme, polarité, nombre d’impulsions)¹⁰ (voir la figure 1 pour une illustration). Bien que chacun de ces paramètres puisse avoir un effet significatif sur les résultats des expériences d’électroporation, la forme d’onde des impulsions a été particulièrement étudiée en détail, car l’énergie électrique de la ou des impulsions appliquées est à l’origine du compromis intrinsèque entre la viabilité cellulaire résultante et l’efficacité de l’électrotransfection⁸.

En règle générale, les expériences d’électroporation sont effectuées à l’échelle macro, où les cellules sont suspendues dans 100 microlitres de tampon entre un ensemble de grandes électrodes à plaques parallèles dans une cuvette d’électroporation. Les électrodes sont généralement fabriquées en aluminium avec une distance d’électrode de 1 à 4 mm. Une fois les cellules chargées manuellement via une pipette, la cuvette est connectée électriquement à un générateur d’impulsions électrique encombrant où l’utilisateur peut régler et appliquer les paramètres de forme d’onde d’impulsion pour électroporer la suspension de cellule. Bien que l’électroporation à grande échelle ou en vrac puisse traiter des densités cellulaires >10⁶ cellules/mL, cette fonctionnalité peut être un gaspillage lors de l’optimisation des paramètres de forme d’onde d’impulsion électrique. Ceci est particulièrement préoccupant lors de l’électroporation de types de cellules primaires où le nombre de personnes cellulaires peut être limité. De plus, en raison de la grande distance entre les électrodes, le générateur d’impulsions doit être capable de fournir de grandes tensions pour atteindre des intensités de champ électrique >1kV / cm¹¹. Ces hautes tensions provoquent une dissipation de puissance résistive à travers le tampon électrolytique entraînant un échauffement Joule, ce qui peut nuire à la viabilité de la cellule résultante¹². Enfin, l’électroporation sur une suspension dense de cellules sera constamment alourdie d’une variabilité innée de l’efficacité de l’électro-transfection et de la viabilité cellulaire qui en résultent. Chaque cellule en suspension pourrait subir une intensité de champ électrique différente en raison des cellules environnantes. Selon que l’intensité du champ électrique expérimenté est augmentée ou diminuée, la viabilité de la cellule ou l’efficacité de l’électrotransfection résultante peuvent être affectées négativement¹¹. Ces inconvénients de l’électroporation à l’échelle macroscopique ont conduit à la poursuite et au développement de technologies alternatives qui fonctionnent à micro-échelle et permettent un meilleur contrôle au niveau de la cellule unique.

Le domaine des BioMEMS, ou systèmes biomédicaux micro-électromécaniques, découle des progrès technologiques réalisés dans l’industrie de la microélectronique. Plus précisément, l’utilisation de procédés de microfabrication pour développer des micro-dispositifs pour l’avancement de la recherche biomédicale. Ces progrès comprennent le développement de réseaux de microélectrodes pour la surveillance électrique in vivo 13, de microélectrodes capacitives pour l’électroporation in situ 14, de dispositifs miniaturisés d’organes sur puce¹⁵, de diagnostics microfluidiques au point de service 16, de biocapteurs 17 et de systèmes d’administration de médicaments 18, y compris des dispositifs de nano- et micro-électroporation ^19,20,21 . En raison de la capacité de concevoir et de fabriquer des dispositifs à la même échelle de taille que les cellules biologiques, les technologies de nano- et micro-électroporation sont avantageuses par rapport à leur homologue à l’échelle macro^22,23. Ces dispositifs d’électroporation éliminent le besoin d’applications d’impulsions haute tension, car des ensembles d’électrodes avec des espacements de 10 à 100 micromètres sont généralement intégrés. Cette caractéristique réduit considérablement le courant à travers l’électrolyte, ce qui réduit l’accumulation de produits d’électrolyse toxiques et les effets du chauffage Joule dans ces systèmes. Les canaux à micro-échelle garantissent également qu’un champ électrique beaucoup plus uniforme est appliqué de manière fiable aux cellules pendant l’application d’impulsions, ce qui se traduit par des résultats plus cohérents²⁴. En outre, il est également courant que des dispositifs de micro-électroporation soient intégrés dans une plate-forme microfluidique qui se prête à une intégration future dans une technologie entièrement automatisée, une capacité hautement souhaitable dans la fabrication de thérapies cellulaires²⁵. Enfin, l’électroporation à l’échelle microscopique permet l’interrogation électrique des événements d’électroporation. Par exemple, le degré de perméabilisation de la membrane cellulaire peut être surveillé en temps réel au niveau d’une seule cellule^26,27. Le but de cette méthode est de décrire la microfabrication, le fonctionnement du système et l’analyse d’un dispositif microfluidique de micro-électroporation monocellulaire capable de mesurer le degré de perméabilisation de la membrane cellulaire pour optimiser les protocoles d’électroporation, tout en augmentant le débit par rapport à l’état de la technique précédent.

La réalisation d’une électroporation au niveau d’une cellule unique n’est plus une technique nouvelle, comme l’ont démontré pour la première fois Rubinsky et al. en 2001 avec le développement d’une technologie d’électroporation de cellules statiques²⁸. Leur micro-dispositif était innovant car ils ont été les premiers à démontrer la capacité de surveiller électriquement l’événement d’électroporation. Cela a également conduit au développement de technologies d’électroporation statique à cellule unique capables de détecter électriquement le degré de perméabilisation de la membrane cellulaire de manière parallélisée afin d’augmenter les débits des dispositifs. Cependant, même avec la parallélisation et le traitement par lots, ces dispositifs manquent cruellement du nombre total de cellules qu’ils peuvent traiter par unité de temps^29,30. Cette limitation a conduit au développement de dispositifs à flux continu capables d’effectuer une micro-électroporation au niveau d’une cellule à des débits beaucoup plus élevés³¹. Cette transition du dispositif, de l’environnement statique à l’environnement à écoulement continu, limite la capacité de surveillance électrique du degré de perméabilisation de la membrane cellulaire après l’application de l’impulsion d’électroporation. La méthode décrite dans ce travail comble le fossé entre ces deux technologies, une technologie de micro-électroporation capable de détecter, pulser et surveiller électriquement le degré de perméabilisation de la membrane cellulaire de cellules individuelles, de manière sérielle à flux continu.

Cette technologie a été récemment décrite dans Zheng et al. Dans ce travail, les capacités de cette technologie ont été introduites avec la réalisation d’une étude paramétrique, où l’amplitude et la durée de l’impulsion d’électroporation ont été modifiées, et le signal électrique qui en a résulté, indiquant la perméabilisation de la membrane cellulaire, a été exploré³². Les résultats ont montré qu’une augmentation de l’intensité de l’impulsion d’électroporation (c.-à-d. augmentation du champ électrique appliqué ou augmentation de la durée de l’impulsion) entraînait une augmentation de la perméabilisation de la membrane cellulaire mesurée. Pour valider davantage le système, un indicateur fluorescent commun de l’électroporation réussie, l’iodure de propidium³³, a été ajouté à la suspension cellulaire, et une image de fluorescence a été capturée immédiatement après l’application de l’impulsion électrique. Le signal optique, c’est-à-dire l’intensité de fluorescence de l’iodure de propidium à l’intérieur de la cellule, était fortement corrélé avec la mesure électrique du degré de perméabilisation de la membrane cellulaire, vérifiant la fiabilité de cette mesure électrique. Cependant, ce travail n’a considéré que la livraison de la petite molécule d’iodure de propidium, qui a peu ou pas de signification traduisible.

Dans ce travail, une nouvelle application de cette technologie est introduite pour améliorer le débit du système tout en fournissant un vecteur d’ADN plasmidique biologiquement actif (ADNp) et en évaluant l’efficacité de l’électro-transfection des cellules replaquées et cultivées après électroporation. Bien que les travaux précédents surpassent les technologies de micro-électroporation existantes capables de mesurer électriquement l’événement d’électroporation, l’état actuel du dispositif nécessite encore de longs temps de transit cellulaire entre le jeu d’électrodes (~ 250 ms) pour effectuer la détection cellulaire, l’application d’impulsions et la mesure de la perméabilisation de la membrane cellulaire. Avec un seul canal, cela limite le débit à 4 cellules/s. Pour lutter contre cette limitation, un nouveau concept d’électroporation contrôlée par rétroaction basée sur la population cellulaire est introduit pour effectuer l’électro-transfection de l’ADNp. En utilisant un tampon d’électroporation par conductivité hypophysiologique, ce système permet l’interrogation électrique de cellules individuelles à travers une multitude d’applications d’impulsions d’électroporation. Sur la base de la réponse électrique, une impulsion d’électroporation « optimale » est ensuite déterminée. Un mode « haut débit » est ensuite mis en œuvre où la détermination de la perméabilisation de la membrane cellulaire est annulée, le débit est augmenté et le rapport cyclique de l’impulsion d’électroporation est adapté au temps de transit de la cellule pour assurer une impulsion par cellule en transit entre les électrodes. Ce travail fournira des détails détaillés sur les étapes de microfabrication pour la fabrication du microdispositif, le matériel / équipement et leur configuration nécessaires pour effectuer l’expérimentation, ainsi que le fonctionnement / l’analyse du dispositif et son efficacité d’électrotransfection (eTE).

Figure 1 : Facteurs expérimentaux affectant les résultats de l’électroporation. (À gauche) Suspension cellulaire – Les facteurs importants à considérer avant le début de l’électroporation comprennent: la charge utile (dans ce cas, l’ADNp), la concentration, la densité cellulaire et les propriétés tampons d’électroporation. Les propriétés tampons d’électroporation à considérer sont la conductivité, l’osmolarité et la composition moléculaire exacte contribuant à ces valeurs. (Milieu) Application d’impulsions-Le type d’impulsion exact (onde carrée vs décroissance exponentielle) et la forme d’onde d’impulsion (impulsion unique vs train d’impulsions) doivent être optimisés pour maximiser à la fois la viabilité cellulaire résultante et l’efficacité de l’électro-transfection. Les trains d’impulsions communs mis en œuvre dans les processus d’électroporation sont généralement composés d’une série d’impulsions haute tension (HT) ou d’une série d’impulsions tournant entre les grandeurs d’impulsion HT et basse tension (BT). (À droite) Récupération cellulaire – Les étapes de traitement en aval, en particulier les milieux de culture cellulaire de récupération vers lesquels les cellules sont transférées, doivent être optimisées. Non présenté (à l’extrême gauche), des étapes supplémentaires de traitement des cellules en amont peuvent être mises en œuvre pour l’optimisation globale du processus d’électroporation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

REMARQUE : Les utilisateurs devraient examiner toutes les FS pour les matériaux et les fournitures utilisés dans ce protocole. L’EPI approprié doit être porté à chaque étape et la technique stérile utilisée pendant l’expérimentation. Les sections 1 à 7 traitent de la fabrication de l’instrument. 1. Fabrication de l’appareil – Conception du masque REMARQUE : Reportez-vous à la figure 2 pour une illustra…

Representative Results

La figure 4 met en évidence les principes de fonctionnement de la détection de perméabilisation membranaire au niveau d’une cellule unique pour une amplitude d’impulsion unique. Après le lancement de l’expérience d’électroporation, l’algorithme de détection de cellule détermine un seuil optimal pour la détection de cellules via une méthode de détection point par point, basée sur la pente. Le système surveille ensuite en permanence (1) un changement négatif significati…

Discussion

La méthodologie présentée dans ce protocole se concentre principalement sur la microfabrication d’un dispositif microfluidique qui est ensuite intégré dans une installation expérimentale spécialisée en électroporation. Le terme « recette », qui est souvent utilisé pour décrire les spécificités du processus de microfabrication, fait allusion à l’importance de suivre / optimiser chaque étape pour fabriquer avec succès un dispositif fonctionnel. Cependant, certaines étapes critiques du procédé, lors…

Materials

150-mm diameter petri dishes	VWR	25384-326	step 6.1.1 to secure wafer
24-well tissue culture plates	VWR	10062-896	step 10.3.6 to plate electroporated cells
33220A Waveform/Function generator	Agilent		step 9.2.3 electroporation pulse generator
4'' Si-wafers	University Wafer		subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication
6-well tissue culture plates	VWR	10062-892	step 8.1.8 to plate cells
Acetone	Fisher Scientific	A18-4	step 2.1.2 for cleaning and  step 5.1 photoresist lift-off
Allegra X-22R Centrifuge	Beckman Coulter		steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells
AutoCAD 2018	Autodesk		subsection 1.1. to design transparency masks
Buffered oxide etchant 10:1	VWR	901621-1L	subsection 3.1 for HF etching
CCD Monochrome microscope camera	Hamamatsu	Orca 285 C4742-96-12G04	step 11.2.3. for imaging
CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP	PCO		subsection 9.3 part of the experimental setup
Conductive Epoxy	CircuitWorks	CW2400	subsection 7.6. for wire attachement
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	14-959-70C	step 8.1.4. for cell centrifuging
Dektak 3ST Surface Profilometer	Veeco (Sloan/Dektak)		step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry
Disposable biopsy punch, 0.75 mm	Robbins Instruments	RBP075	step 6.2.3 for inlet access
Disposable biopsy punch, 3 mm	Robbins Instruments	RBP30P	step 6.2.3 for outlet access
DRAQ5	abcam	ab108410	step 11.2.2. for live cell staining
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	ThermoFisher Scientific	11885084	step 8.1.2. part of media composition
E3631A Bipolar Triple DC power supply	Agilent		step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup
Eclipse TE2000-U Inverted  Microscope	Nikon		subsection 9.3. part of the experimental setup
EVG620 UV Lithography System	EVG		step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure
Fetal Bovine Serum	Neuromics	FBS001	step 8.1.2. part of media composition
FS20 Ultrasonic Cleaner	Fisher Scientific		subsection 5.1. for photoresist lift-off
Glass Media Bottle with Cap, 100mL	Fisher Scientific	FB800100	step 8.2.1. for buffer storage
Glass Media Bottle with Cap, 500mL	Fisher Scientific	FB800500	step 8.1.2.for media storage
HEK-293 cell line	ATCC	CRL-1573	subsection 8.1 for cell culturing
HEPES buffer solution	Sigma Aldrich	83264-100ML-F	step 8.2.1 part of electroporation buffer composition
Hexamethyldisilazane	Sigma Aldrich	379212-25ML	step 2.2.3 adhesion promoter
HF2LI Lock-in Amplifier	Zurich Instruments		subsection 9.2 part of the experimental setup
HF2TA Current amplifier	Zurich Instruments		subsection 9.2 part of the experimental setup
Isopropyl Alcohol	Fisher Scientific	A459-1	step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS
IX81 fluorescence microscope	Olympus		step 11.2.3 for imaging
L-Glutamine Solution	Sigma Aldrich	G7513-20ML	step 8.1.2. part of media composition
M16878/1BFA 22 gauge wire	AWC	B22-1	subsection 7.5 for device fabrication
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	208337-100G	step 8.1.2 part of electroporation buffer composition
MF 319 Developer	Kayaku Advanced Materials	10018042	step 2.2.9. photoresist developer
Microposit S1818 photoresist	Kayaku Advanced Materials	1136925	step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning
Microscope slides, 75 x 25 mm	VWR	16004-422	step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate
Model 2350 High voltage amplifier	TEGAM	2350	step 9.2.5. part of the experimental setup
National Instruments LabVIEW	National Instruments		data acquisition
Needle, 30G x 1 in	BD Scientific	305128	step 10.1.1. part of the system priming
PA90 IC OPAMP Power circuit	Digi-key	598-1330-ND	Part of the custom circuit
Penicillin-Streptomycin	Sigma Aldrich	P4458-20ML	step 8.1.2. part of media composition
Plasmid pMAX-GFP	Lonza	VCA-1003	step 8.3.4. for intracellular delivery
Plastic tubing, 0.010'' x 0.030"	VWR	89404-300	step 10.1.2. for system priming
Platinum targets	Kurt J. Lesker		subsection 4.2. for physical vapor deposition
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9333-500G	step 8.2.1. part of electroporation buffer composition
Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump	Harvard Apparatus	MA1 70-2213	step 10.1.4. for system priming
PVD75 Physical vapor deposition system	Kurt J. Lesker		subsection 4.1. for physical vapor deposition
PWM32 Spinner System	Headway Research		steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist
PX-250 Plasma treatment system	March Instruments		subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding
SDG1025 Function/Waveform generator	Siglent		step 9.2.2. part of the experimental setup
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	S8045-500G	step 8.2.1. part of electroporation buffer composition
SU-8 2010 negative photoresist	Kayaku Advanced Materials	Y111053	step 2.1.7. for microfluidic channel patterning
SU-8 developer	Microchem	Y010200	step 2.1.12. for photoresist developing
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903-1KG	step 8.2.1. part of electroporation buffer composition
Sylgard 184 elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	step 6.2.1  10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent
Syringe, 1 ml	BD Scientific	309628	step 8.3.4. part of system priming
SZ61 Stereomicroscope System	Olympus		subsection 7.3. for channel and electrode alignment
Tissue Culture Treated T25 Flasks	Falcon	353108	step 8.1.2 for cell culturing
Titanium targets	Kurt J. Lesker		subsection 4.2. for physical vapor deposition
Transparency masks	CAD/ART Services		steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	448931-10G	step 6.1.2. for wafer silanization
Trypsin-EDTA solution	Sigma Aldrich	T4049-100ML	steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting