Nous présentons ici des protocoles de détection de l’oxyde nitrique et de ses dérivés biologiquement pertinents à l’aide de tests basés sur la chimiluminescence avec une sensibilité élevée.
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Article de méthode
Tests basés sur la chimiluminescence pour la détection de l’oxyde nitrique et de ses dérivés à partir de l’autoxidation et des composés nitrosés
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’activité de l’oxyde nitrique (NO) in vivo est le résultat combiné de ses effets directs, de l’action de ses dérivés générés par l’autoxidation du NO et des effets des composés nitrosés. La mesure des métabolites du NO est essentielle pour étudier l’activité du NO à la fois au niveau vasculaire et dans d’autres tissus, en particulier dans les milieux expérimentaux où le NO exogène est administré. Les tests de chimiluminescence à base d’ozone permettent de mesurer avec précision les métabolites du NO et du NO dans les fluides (y compris le plasma, les homogénats tissulaires, les cultures cellulaires) et les mélanges gazeux (p. ex., l’haleine expirée). Le NO réagit avec l’ozone pour générer du dioxyde d’azote dans un état excité. L’émission de lumière qui en résulte permet la photodétection et la génération d’un signal électrique reflétant la teneur en NO de l’échantillon. Les aliquotes du même échantillon peuvent être utilisées pour mesurer des métabolites spécifiques du NO, tels que le nitrate, le nitrite, les S-nitrosothiols et les complexes fer-nitrosyle. En outre, le NO consommé par l’hémoglobine sans cellules est également quantifié avec une analyse de chimiluminescence. Une illustration de toutes ces techniques est fournie.
Introduction
Depuis que Salvador Moncada et les lauréats du prix Nobel Robert Furchgott, Louis Ignarro et Ferid Murad ont identifié l’oxyde nitrique (NO) comme le facteur de relaxation dérivé de l’endothélium (EDRF) précédemment connu, le rôle central du NO a été établi dans plusieurs mécanismes clés couvrant la biologie vasculaire, les neurosciences, le métabolisme et la réponse de l’hôte 1,2,3,4,5,6,7 . L’administration exogène de gaz NO est devenu....
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Protocole
Les procédures indiquées dans ce protocole sont conformes au comité d’examen du Massachusetts General Hospital. Les échantillons de sang utilisés avaient été prélevés lors d’une étude précédente et ont été anonymisés aux fins actuelles18.
REMARQUE: Voir les instructions du fabricant pour des conseils spécifiques concernant les connexions optimales entre les tubes et la verrerie constituant le récipient de purge, le lavage et l’entretien général. Les connexions doivent être fermes et soigneusement faites pour ne pas endommager la verrerie. Identifier les composants de la cuve de purge en verre : conduite d’entrée de g....
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Résultats
La consommation de NO par dosage de l’Hb sans cellules a été utilisée dans des échantillons contenant des concentrations connues d’oxyHb sans cellules (figure 4). Comme un hème d’oxyHb libère stœchiométriquement une molécule de NO dans le test, l’oxyHb purifié sans cellule est utilisé pour construire la courbe d’étalonnage pour le test (figure supplémentaire 3).
La relation dose-réponse entre l’Hb sans cellules (mesurée avec un test colorimétrique.......
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Discussion
En raison de la sensibilité élevée, les tests à base de chimiluminescence pour la détermination du NO et des composés apparentés présentent un risque élevé de contamination par le NO2. Chaque réactif (en particulier la solution bloquant le NO2) et chaque diluant (y compris le ddH2O) utilisé dans l’expérience doivent être testés pour sa teneur en NO2- afin de corriger le signal de fond. Le nitrite est extrêmement réactif avec une demi-vie dans le.......
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Déclarations de divulgation
L.B. reçoit un soutien salarial de K23 HL128882/NHLBI NIH en tant que chercheur principal pour ses travaux sur l’hémolyse et l’oxyde nitrique. LB reçoit des subventions de « Fast Grants for COVID-19 research » au Mercatus Center de l’Université George Mason et d’iNO Therapeutics LLC. B.Y. est soutenu par des subventions d’un NHLBI/#R21HL130956 et du DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. a reçu des brevets à MGH sur la production électrique d’oxyde nitrique.
L.B. et B.Y. ont déposé une demande de brevet pour l’administration de NO dans la maladie COVID-19 numéro de demande PCT: PCT/US2021/036269 déposé le 7 juin 2021. RWC reçoit un soutien salarial d’Unitaid en tant que chercheur principal pour le développement technologique visant à un diagnostic décentralisé de la tuberculose chez les enfants situés dans des milieux à faibles ressources.
Remerciements
Les protocoles rapportés dans ce manuscrit ont été rendus possibles grâce aux contributions accumulées par d’anciens boursiers du laboratoire de recherche en anesthésie en soins intensifs du Dr Warren Zapol, département d’anesthésie du Massachusetts General Hospital. Nous reconnaissons la contribution des Drs Akito Nakagawa, Francesco Zadek, Emanuele Vassena, Chong Lei, Yasuko Nagasaka, Ester Spagnolli et Emanuele Rezoagli.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Acide acétique | Sigma | 45754 | 500 mL - liquide |
| Antimousse B Émulsion | Sigma | A5757 | 250 mL - liquide |
| DETA NONOate | Cayman | 82120 | 10 mg |
| Gibco DPBS (1x) sans calcium, sans magnésium | ThermoFisher | 14190144 | 500 mL |
| Acide hydroochlorique 37 % (1 M) | Sigma | 258148 | 500 mL - liquide |
| Iode | SAFC | 207772 | 100 g - solide |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | |
| Chlorure de mercure (II) réactif ACS > 99,5 | Sigma | 215465 | 100 g - solide (dissous dans l’eau) |
| Système de purification d’eau Mili-Q | Millipore | ||
| Modèle 705 RN 50 &mu ; Seringue L | Hamilton | 80530 | Seringue d’un microlitre |
| Modèle 802 N 25 &mu ; L Seringue | Hamilton | 84854 | Seringue d’un microlitre |
| N-éthylmaléimide | Sigma | 4260 | 25 g - |
| Analyseur d’oxyde nitrique cristallin + Bundle Logiciel - Récipient de purge | Zysense | NOA 280i | Détecteur de chimiluminescence |
| Nonidet p-40 ; (NP-40) | ThermoFisher | 85125 | 10 % - 500 mL |
| Hexacyanoferrate de potassium (III) Réactif ACS&ge ; 99 % | Sigma | 244023 | 100 g - poudre |
| Iodure de potassium Réactif ACS > 99 % | Sigma | 221945 | 100 g - |
| cristal solide de nitrite de potassium. Pour l’analyse EMSURE ACS | Supelco | 105067 | 250 g - cristallin |
| PowerGen 125 | Fisher Scientific | 14-359-251 | Homogénéisateur mécanique |
| RV3 Pompe à palettes rotatives à deux étages | Edwards | A65201906 | Pompe à vide - Livré avec l’analyseur |
| Héparine de sodium - BD Hemogard Clo | BD Biosciences | BD367871 | 75 unités USP |
| Réactif ACS anhydre d’hydroxyde de sodium &ge ; 97 % | Sigma | 795429 | 1 kg - pastilles |
| Nitrate de sodium Réactif ACS &ge ; 99 % | Sigma | 221341 | 500 g - poudre |
| Nitrite de sodium &ge ; 99 % | Sigma | S2252 | 500 g - cristallin |
| Sulfanilamide &ge ; 98 % | Sigma | S9251 | 100 g - solide |
| Chlorure de vanadium (III) | Sigma | 112393 | 25 g - solide - Attention (exothermique) |
| Whatman 1 Papier Filtre | Sigma | WHA10010155 |
Références
- Palmer, R. M. J., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
- Furchgott, R. F.
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Réimpressions et autorisations
