Summary
이 연구는 미토콘드리아 부피, 미토콘드리아 막 전위, 활성 산소 종 수준, 미토콘드리아 호흡 사슬 조성 및 미토콘드리아 DNA의 변화를 감지하기 위해 두 개의 형광 리포터 또는 항체를 사용한 유세포 분석 및 이중 염색을 기반으로 여러 미토콘드리아 기능 매개 변수를 측정하는 새로운 접근 방식을보고합니다.
Abstract
미토콘드리아는 많은 신경 퇴행성 질환의 병태생리학에서 중요하다. 미토콘드리아 부피, 미토콘드리아 막 전위 (MMP), 활성 산소 종 (ROS)의 미토콘드리아 생산 및 미토콘드리아 DNA (mtDNA) 복제 수의 변화는 종종 이러한 과정의 특징입니다. 이 보고서는 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 및 iPSC 유래 신경 및 신경교 세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 여러 미토콘드리아 매개변수를 측정하기 위한 새로운 유세포 분석 기반 접근 방식을 자세히 설명합니다. 이 흐름 기반 전략은 살아있는 세포를 사용하여 미토콘드리아 부피, MMP 및 ROS 수준을 측정하고 고정 세포를 사용하여 미토콘드리아 호흡 사슬(MRC) 및 미토콘드리아 전사 인자 A(TFAM)와 같은 mtDNA 관련 단백질의 구성 요소를 추정합니다.
MitoTracker Green(MTG), 테트라메틸로다민 에틸 에스테르(TMRE) 및 MitoSox Red를 포함한 형광 리포터와의 공동 염색을 통해 미토콘드리아 부피, MMP 및 미토콘드리아 ROS의 변화를 정량화하고 미토콘드리아 함량과 관련시킬 수 있습니다. MRC 복합체 서브유닛 및 외부 미토콘드리아 막 20(TOMM20)의 트랜스로카제에 대한 항체를 이용한 이중 염색은 MRC 서브유닛 발현의 평가를 허용한다. TFAM의 양은 mtDNA 복제 수에 비례하므로 TOMM20 당 TFAM의 측정은 미토콘드리아 부피 당 mtDNA의 간접적 인 측정을 제공합니다. 전체 프로토콜은 2-3 시간 내에 수행 할 수 있습니다. 중요하게도, 이러한 프로토콜은 유세포 분석을 사용하여 미토콘드리아 부피 당 전체 수준과 특정 수준 모두에서 미토콘드리아 매개 변수를 측정 할 수 있습니다.
Introduction
미토콘드리아는 거의 모든 진핵 세포에 존재하는 필수 세포 기관입니다. 미토콘드리아는 산화적 인산화를 통해 아데노신 삼인산(ATP)을 생성하여 에너지 공급을 담당하고 생합성 및 대사를 위한 대사 매개체 역할을 합니다. 미토콘드리아는 ROS 생성, 세포 사멸 및 세포 내Ca2+ 조절과 같은 다른 많은 중요한 세포 과정에 깊이 관여합니다. 미토콘드리아 기능 장애는 파킨슨병(PD), 알츠하이머병(AD), 헌팅턴병(HD), 프리드라이히 운동실조증(FRDA) 및 근위축성 측삭 경화증(ALS)1을 비롯한 다양한 신경퇴행성 질환과 관련이 있습니다. 증가된 미토콘드리아 기능 장애 및 mtDNA 이상도 인간의 노화에 기여하는 것으로 생각됩니다 2,3.
다양한 유형의 미토콘드리아 기능 장애가 신경 퇴행성 질환에서 발생하며 미토콘드리아 부피의 변화, MMP 탈분극, ROS 생성 및 mtDNA 복제 수의 변화가 일반적입니다 4,5,6,7. 따라서 이러한 기능 및 기타 미토콘드리아 기능을 측정하는 능력은 질병 메커니즘을 연구하고 잠재적 인 치료제를 테스트 할 때 매우 중요합니다. 더욱이, 인간 신경퇴행성 질환을 충실하게 복제하는 동물 모델의 부족을 고려할 때, 뇌 세포에서 인간 질병을 요약하는 적절한 시험관내 모델 시스템을 확립하는 것은 이러한 질병에 대한 더 큰 이해와 새로운 치료법의 개발을 향한 중요한 단계입니다 2,3,8,9.
인간 iPSC는 뉴런 및 비뉴런 세포(즉, 신경교 세포)를 비롯한 다양한 뇌 세포를 생성하는데 사용될 수 있으며, 신경퇴행성 질환과 관련된 미토콘드리아 손상은 두 세포 유형 3,10,11,12,13 모두에서 발견되었다. 신경 및 신경교 계통으로의 iPSC 분화를 위한 적절한 방법이 이용가능하다14,15,16. 이 세포는 시험관 내 질병 모델링 및 약물 스크리닝을 위한 고유한 인간/환자 플랫폼을 제공합니다. 또한 환자에서 파생되기 때문에 iPSC 유래 뉴런과 신경교 세포는 인간에서 일어나는 일을보다 정확하게 반영하는 질병 모델을 제공합니다.
현재까지 iPSC, 특히 살아있는 뉴런과 신경교 세포에서 여러 미토콘드리아 기능 파라미터를 측정하는 편리하고 신뢰할 수 있는 방법은 거의 없습니다. 유세포 분석의 사용은 과학자에게 단일 세포에서 미토콘드리아 기능을 포함한 생물학적 매개 변수를 측정하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 이 프로토콜은 iPSC의 신경 줄기 세포(NSC), 뉴런 및 신경교 성상세포를 포함한 다양한 유형의 뇌 세포 생성에 대한 세부 정보와 iPSC 및 iPSC 유래 신경 및 신경교 세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 여러 미토콘드리아 매개변수를 측정하는 새로운 유세포 분석 기반 접근 방식을 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 유세포분석을 사용하여 미토콘드리아 부피, MMP, 미토콘드리아 ROS 수준, MRC 복합체 및 TFAM을 측정하기 위한 공동염색 전략을 제공합니다. 미토콘드리아 부피 또는 질량의 측정을 통합함으로써, 이러한 프로토콜은 또한 미토콘드리아 단위 당 총 수준과 특정 수준의 측정을 허용합니다.
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Protocol
참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 매체 및 솔루션의 레시피에 대해서는 재료 표 및 보충 표 S1 을 참조하십시오.
1. 인간 iPSC를 NCS, 도파민성(DA) 뉴런 및 성상세포로 분화
- 매트릭스 코팅 플레이트를 준비하십시오.
- 매트릭스 5mL가 담긴 바이알을 얼음에서 밤새 해동합니다. 1mL의 매트릭스를 차가운 고급 Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 / Ham의 F-12 (고급 DMEM / F12) (1 % 최종 농도)로 희석하십시오. 1mL 분취량을 만들어 -20°C에서 보관합니다.
- 매트릭스 용액을 4°C에서 해동하고(차갑게 유지) 6웰(6웰 플레이트에서 웰당 1mL)을 코팅합니다.
- 매트릭스 코팅 플레이트를 37°C에서 가습된 5% CO2/95% 공기 인큐베이터에 1시간 동안 놓습니다. 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내 실온 (RT)과 평형을 이루십시오.
알림: 코팅 후 3일 이내에 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 코팅된 플레이트는 4°C에서 최대 2주 동안 저장될 수 있다. 사용하기 전에 꺼내서 RT로 예열하는 것을 잊지 마십시오. 장기간 보관하려면 매트릭스의 건조를 방지하기 위해 코팅된 플레이트에 1mL의 iPSC 배양 배지를 추가합니다.
- iPSC 해동
- 매트릭스 코팅 플레이트를 RT 또는 37°C의 인큐베이터에서 20-30분 동안 예열합니다. RT에서 필요한 양의 iPSC 배양 배지를 예열합니다.
- 예열된 iPSC 배양 배지 6mL를 Y-27632 ROCK 억제제 12μL와 혼합하여 최종 농도 10μM을 얻습니다.
- iPSCs의 냉동 바이알을 수조에서 37°C에서 작은 얼음 조각이 남을 때까지 부분적으로 해동합니다.
- 12μL의 ROCK 억제제와 함께 예열된 iPSC 배양 배지 1mL를 세포에 천천히 추가합니다. iPSC가 있는 바이알의 액체 함량을 5mL 피펫을 사용하여 6웰 사전 코팅된 플레이트의 한 웰에 적가합니다.
- 플레이트를 수직 방향으로 움직여 우물 내용물을 혼합하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)(1x)(Ca 2+/Mg 2+-free)(6웰 플레이트에서 웰당 4mL)로 세척한 후24시간 후에 iPSC 배양 배지를 교체합니다.
알림: 후속 급지에 ROCK 억제제를 첨가하지 마십시오. iPSC 배양 배지를 매일 교체하십시오.
- iPSC의 계대 배양
- 매트릭스 코팅 플레이트를 RT 또는 37°C의 인큐베이터에서 20-30분 동안 예열합니다. RT에서 필요한 양의 iPSC 배양 배지를 예열합니다.
- 세포를 함유하는 플레이트로부터 배양 배지를 흡인한다. iPSC를 DPBS(1x)(Ca 2+/Mg2+-free)(6웰 플레이트에서 웰당 4mL)로 헹굽니다.
- EDTA(0.5mM)(6웰 플레이트에서 웰당 1mL)를 추가합니다. 콜로니의 가장자리가 웰에서 들어 올려지기 시작할 때까지 플레이트를 37 ° C에서 배양합니다 (보통 3-5 분). EDTA를 흡인합니다.
- 예열된 iPSC 배양 배지(6웰 플레이트에서 웰당 4mL)를 추가하고 10mL 멸균 피펫을 사용하여 iPSC 콜로니를 한 번 강제로 분리합니다. 세포 덩어리가 단일 세포로 부서질 수 있으므로 위아래로 피펫팅하지 마십시오.
- 각 웰의 내용물을 매트릭스 코팅된 6-웰 플레이트(6-웰 플레이트에서 웰당 2mL)의 2개의 개별 웰로 옮기고 37°C에서 배양합니다. 피펫팅하는 동안 현탁액에 기포가 발생하지 마십시오.
알림: 인큐베이터에 보관하기 전에 플레이트를 부드럽게 흔듭니다. 분할 비율은 1:2(하나의 웰을 2개의 새 웰로)에서 1:4(웰 하나를 4개의 새 웰로)일 수 있습니다. - 식민지가 좋은 크기와 연결로 60 % 합류점에 도달 할 때까지 매일 배지를 교체하십시오.
- 신경 유도 및 신경 전구 생성
- 500mL의 화학적으로 정의된 배지(CDM), 500mL의 신경 유도 배지(NIM) 및 500mL의 신경 줄기 세포 무혈청(NSC SF) 배지를 준비합니다.
- 세포를 DPBS(1x)(Ca 2+/Mg2+-free)(6-웰 플레이트에서 웰당 4mL)로 헹구고 NIM(6-웰 플레이트에서 웰당 3mL)을 추가합니다. Day 0으로 설정합니다.
- 1일차, 3일째 및 4일째에 NIM(6웰 플레이트에서 웰당 3mL)을 교체하고 매일 현미경 검사로 관찰합니다.
- 5일째에 아래 설명된 대로 신경 로제트를 현탁액 배양으로 분리합니다.
- DPBS(1x)(Ca 2+/Mg2+-free)(6웰 플레이트에서 웰당 4mL)로 부드럽게 한 번 세척합니다. 콜라게나제 IV (6 웰 플레이트에서 웰 당 1mL)를 넣고 인큐베이터에서 1 분 동안 유지합니다. 콜라게나제 IV를 흡인하고 DPBS(1x)(6웰 플레이트에서 웰당 4mL)로 부드럽게 한 번 세척합니다.
- 웰당 2mL의 NSC SF 배지를 6웰 플레이트에 추가합니다. 200μL 피펫 팁을 사용하여 그리드를 그려 웰의 바닥을 긁어 세포를 분리합니다.
- 6-웰 플레이트로부터 세포 현탁액을 10cm 비부착성 접시에 모은다. NSC SF 배지로 부피를 12mL로 구성합니다.
- 응집을 방지하기 위해 인큐베이터의 궤도 셰이커에서 65-85rpm으로 부착되지 않은 접시를 흔듭니다.
- DA 뉴런 분화
- 7일째에 100ng/mL 섬유아세포 성장 인자-8b(FGF-8b)가 보충된 CDM 12mL를 넣고 인큐베이터의 안와 셰이커에 접시를 놓습니다.
- 8-13 일에 2 일마다 배지를 교체하고 매일 현미경 검사로 관찰하십시오.
- 14일째에 100ng/mL FGF-8b 및 1μM 푸르모르파민(PM)이 보충된 CDM 12mL를 추가합니다. 인큐베이터의 궤도 셰이커에 접시를 놓습니다.
- 15-20 일에 2 일마다 배지를 교체하고 매일 현미경으로 세포를 관찰하십시오.
- 더 큰 구를 분해하기 위해 1000μL 팁을 사용하여 구를 기계적으로 통과시킵니다.
알림: 비율은 1:2일 수 있습니다(한 접시에서 2개의 새 요리로).
- 차별화 종료
- 6웰 플레이트 또는 커버슬립을 아래 설명된 대로 Poly-L-오르니틴(PLO) 및 라미닌으로 코팅합니다.
- 6-웰 플레이트를 웰당 1mL의 PLO로 코팅하고, 플레이트를 37°C에서 20분 동안 인큐베이션한다. PLO 용액을 흡인합니다.
- UV 하에서 플레이트를 20분 동안 소독합니다. DPBS(1x)(6웰 플레이트에서 웰당 4mL)로 웰을 두 번 헹굽니다.
- 5μg/mL 라미닌 용액(6웰 플레이트에서 웰당 1mL)을 웰에 넣고 37°C에서 2시간 동안 배양합니다. 라미닌을 흡입하고 플레이팅하기 전에 DPBS(1x)(6웰 플레이트에서 웰당 4mL)로 웰을 한 번 잠시 세척합니다.
- 50mL 튜브에 모든 구체(1.5.5단계)를 수집하고 DPBS(1x)를 채웁니다. 300× g 에서 5분 동안 회전합니다. 상청액을 흡인하십시오.
- 수조에서 37°C에서 10분 동안 2mL의 세포 해리 시약( 재료 표 참조)과 함께 배양한 후 200μL 피펫으로 부드럽게 분쇄합니다(거품 형성을 피하면서 구의 크기에 따라 20-50회).
- 세포 해리 시약을 10% 소 태아 혈청(FBS)으로 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM) 2mL로 중화하고 세포가 포함된 50mL 원추형 튜브를 RT에서 5 분 동안 300×g으로 원심분리합니다. 상청액을 흡인합니다.
- 10ng/mL 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF) 및 10ng/mL 신경교 세포주 유래 신경영양 인자(GDNF)가 보충된 CDM 1mL를 추가하여 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포 펠릿을 재현탁하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
- 플레이트에서 라미닌 용액을 흡입하고(단계 1.6.1.3), DPBS(1x)(6웰 플레이트에서 웰당 4mL)로 간단히 세척하고, 10ng/mL BDNF 및 10ng/mL GDNF가 보충된 3mL의 CDM에 미리 코팅된 플레이트 또는 커버슬립에 세포를 시드합니다(단계 1.6.5에서). 4 일마다 세포를 먹이십시오.
참고: 차별화 문화는 몇 주에서 최대 3개월 동안 유지할 수 있습니다. 신경 형태는 일반적으로 종료 후 2주 후에 나타나며 그 시점부터 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다. BDNF 및 GDNF는 더 긴 유지 관리 (최대 2 개월)를 위해 배양에 필요하지 않습니다.
- 6웰 플레이트 또는 커버슬립을 아래 설명된 대로 Poly-L-오르니틴(PLO) 및 라미닌으로 코팅합니다.
- NSC 생성
- 코트 매트릭스 플레이트.
- 50mL 튜브에 모든 신경구(1.4단계에서 생성됨)를 수집하고 DPBS(1x)(Ca 2+/Mg2+-free)를 채웁니다. 300 × g 에서 5 분 동안 회전하십시오. 상청액을 흡인하십시오.
- 펠릿을 수조에서 37°C에서 10분 동안 2mL의 세포 해리 시약과 함께 배양한 다음 200μL 피펫으로 부드럽게 분쇄합니다(기포 형성을 피하면서 구의 크기에 따라 20-50회).
- 10% FBS로 2mL의 DMEM으로 중화하고 RT에서 5분 동안 300× g 의 세포가 포함된 50mL 원추형 튜브를 원심분리합니다. 상청액을 흡인합니다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포 펠릿을 재현탁합니다.
- 사전 코팅된 플레이트에서 매트릭스 용액을 흡인하고 NSC SF 배지(6웰 플레이트에서 웰당 3mL)에서 프리코팅된 플레이트의 세포를 시드합니다. 2-3 일마다 세포를 먹이고 합류 할 때 세포를 나눕니다.
참고: 이 단계부터 NSC를 확장하고 동결할 수 있습니다.
- 아교 세포 분화
- NSC에서 성상 세포 분화
- 500mL의 성상 세포 분화 배지를 준비합니다.
- NSC SF 배지로 폴리 -D- 라이신 (PDL) 코팅 플레이트 / 커버 슬립에 NSC를 시드합니다.
- 다음 날, 세포를 DPBS(1x)(Ca 2+/Mg2+-free)(6웰 플레이트에서 웰당 4mL)로 헹구고 성상세포 분화 배지(6웰 플레이트에서 웰당 3mL)를 추가합니다. Day 0으로 설정합니다.
- 매일 현미경으로 NSC를 관찰하고 1일부터 27일까지 2일마다 성상세포 분화 배지(6웰 플레이트에서 웰당 3mL)를 교체합니다.
- 성상 세포 성숙
- 성상 세포 성숙 배지를 준비하십시오.
- 28일째에 세포를 DPBS(1x)(6웰 플레이트에서 웰당 4mL)로 헹구고 성상세포 성숙 배지(6웰 플레이트에서 웰당 3mL)를 추가합니다.
- 29일 이후에는 매일 현미경으로 세포를 관찰하고 2일마다 성상세포 성숙 배지(6웰 플레이트에서 웰당 3mL)를 교체합니다.
- 성숙 1 개월 후, 세포를 확장하고이 단계부터 냉동 보존하십시오.
참고: 이 단계에서는 셀 수가 증가합니다. 세포를 분할 할 때, PDL 코팅 커버 슬립은 배양에 필요하지 않습니다.
- NSC에서 성상 세포 분화
2. 면역세포화학 및 면역형광염색에 의한 세포 특성 분석
- 배양 기간이 끝나면 세포와 함께 커버 슬립을 12 웰 플레이트로 옮깁니다.
세포를 인산염 완충 식염수(PBS)(1x)로 2회 헹구고 RT에서 4% 파라포름알데히드(PFA)(12웰 플레이트에서 웰당 0.5mL)에서 10분 동안 배양합니다.
참고: 고정된 샘플은 2mL의 PBS(1x)로 덮고 면역 염색에 필요할 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다. PFA는 독성이 있으며 암을 유발하는 것으로 의심됩니다. 피부와 눈에 노출되는 것을 방지하고 화학 흄 후드 아래에서 작업하십시오. - 세포를 차단 및 투과화하고, PBS(1x), 0.3% 트리톤 X-100, 및 10% 정상 염소 혈청을 함유하는 블로킹 완충액과 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 항-옥타머-결합 전사 인자 4(Oct4) 및 항-단계 특이적 배아 항원-4(SSEA4)를 갖는 iPSC, 항-성 결정 영역 Y 박스-2(Sox2) 및 항-네스틴을 갖는 NSC, 항-쌍을 이루는 박스-6(Pax6) 및 항-네스틴을 갖는 신경구체, 항-신경교세포-섬유소 산성 단백질(GFAP) 및 항-S100 칼슘-결합 단백질 β(S100β)을 갖는 성상세포, 항-티로신 하이드록실라제(TH)를 갖는 DA 뉴런을 염색하고, 항-β III 튜불린(Tuj 1), 항-시냅토피신 및 항-PSD-95(12웰 플레이트에서 웰당 1차 항체 용액 0.5mL, 자세한 내용은 재료 표 참조).
- 샘플을 PBS(1x)로 3회 10분 동안 부드럽게 흔들면서 세척합니다.
- 2차 항체 용액(블로킹 버퍼 중 1:800, 12웰 플레이트에서 웰당 Alexa Fluor 2차 항체 용액 0.5mL)과 함께 RT에서 부드럽게 흔들면서 1시간 동안 배양합니다.
- 세포를 PBS (1x) 중 Hoechst 33342 (12 웰 플레이트에서 웰 당 0.5 mL)로 RT에서 15 분 동안 배양하여 핵을 표지합니다.
- 세포를 장착 매체로 장착하고 RT에서 밤새 건조시켜 어둠 속에서 형광 현미경으로 이미징합니다. 현미경 설정 및 매개변수에 대해서는 보충 그림 S1 을 참조하십시오.
3. 살아있는 세포에서 미토콘드리아 부피, MMP 및 미토콘드리아 ROS의 유세포 분석 측정
- 세포가 50%-60% 컨플루언시에 도달할 때까지 6웰 플레이트의 4웰에 세포를 별도로 시드합니다. 이 네 개의 우물에 #1, #2, #3 및 #4라는 레이블을 지정합니다.
- 배양 기간이 끝나면 다음과 같이 5개의 개별 염색 용액(6웰 플레이트에서 웰당 500μL)을 준비합니다: #1 전용 배양 배지(대조군을 위한 세포만을 포함하는 웰 #1); FCCP (100 μM)를 포함하는 # 2-1; 배양 배지에 FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM)를 함유하는 #2-2; TMRE (100 nM) + MTG (150 nM)를 함유하는 #3 배지; #4는 10% FBS를 가진 PBS(1x) 중 미토삭스 레드(10μM) + MTG(150nM)를 함유합니다. 이러한 화합물 및 유세포분석 설정에 대한 자세한 내용은 그림 1A, 보충 표 S2 및 재료 표를 참조하십시오.
알림: 배양 배지를 사용하여 염색 용액을 준비하십시오. 사용하기 전에 RT에서 배지와 PBS(1x)를 예열하십시오. FCCP는 독성이 있습니다. 피부와 눈의 노출을 방지하고 화학 흄 후드 아래에서 작업하십시오. - #2 웰에서 배지를 흡입하고 #2-1 용액을 추가합니다(FCCP만 해당). 세포를 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
- #2 및 #3 웰에서 배지를 흡입하고 #2 웰에 #2-2 용액(FCCP + TMRE + MTG)을 추가하고 #3 웰에 #3 용액(TMRE + MTG)을 추가합니다. 세포를 37°C에서 45분 동안 배양한다.
- #4 웰에서 배지를 흡입하고 #4 용액(MitoSox Red + MTG)을 추가합니다. 세포를 37°C에서 15분 동안 배양한다.
- 모든 우물에서 매체를 흡인하십시오. PBS(1x)(6웰 플레이트에서 웰당 4mL)로 세척합니다. 37°C에서 5분 동안 1mL의 세포 해리 시약(6웰 플레이트에서 웰당 1mL)을 사용하여 세포를 분리합니다. 1mL의 DMEM에서 세포 해리 시약을 10% FBS(6웰 플레이트에서 웰당 2mL)로 중화합니다.
- 15mL 원추형 튜브에 모든 웰의 내용물을 수집합니다. 튜브를 300×g에서 5 분 동안 원 심분리합니다. 펠릿을 PBS(1x)로 한두 번 씻습니다.
- 상청액을 흡입하되 튜브에 약 100μL를 남겨 둡니다. 세포 펠릿을 300μL의 PBS(1x)에 재현탁시킨다. 세포를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. RT에서 튜브를 어둠 속에 보관하십시오.
- 유세포 분석기 (3 개의 파란색 및 1 개의 빨간색 레이저 구성)를 사용하여 세포를 분석합니다. 530/30 대역통과 필터를 사용하여 필터 1(FL1)에서 MTG, 대역통과 필터 585/40을 사용하여 필터 2(FL2)의 TMRE, 510/580 대역통과 필터를 사용하여 필터 3(FL3)에서 MitoSox Red를 검출합니다.
4. 고정 세포에서 MRC 복합체 서브유닛 및 TFAM의 유세포분석 측정
- 배양 기간이 끝나면 세포 해리 시약을 추가하여 세포를 분리합니다 (~ 106). 그런 다음 펠릿을 넣고 15mL 튜브에서 세포를 수집합니다. PBS(1x)로 원심분리하여 세포를 300 ×g에서 5분 동안 2회 원심분리하여 세척한다.
- 세포를 RT에서 10분 동안 1.6% PFA(15mL 튜브에 1.6% PFA 1mL)에 고정합니다. PBS(1x)로 원심분리하여 세포를 300 ×g에서 5분 동안 2회 원심분리하여 세척한다.
- -20°C에서 20분 동안 얼음처럼 차가운 90% 메탄올(15mL 튜브에 90% 메탄올 1mL)로 세포를 투과시킵니다.
- PBS (1x) 중 분획 V(15mL 튜브 중 블로킹 완충액 1mL)-0.3M 글리신, 5% 염소 혈청 및 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 블로킹 완충액에서 샘플을 차단한다. 세포를 PBS(1x)로 원심분리하여 세포를 2회 세척한다(단계 3.7에서와 같이).
- 복합체 I 서브유닛의 측정을 위한 항-NDUFB10 (1:1,000), 콤플렉스 II 서브유닛의 측정을 위한 항숙시네이트 탈수소효소 복합체 플라보단백질 서브유닛 A (SDHA, 1:1,000) 및 콤플렉스 IV 서브유닛의 측정을 위한 항-COX IV (1:1,000), 및 Alexa Fluor 488 (1:400)과 접합된 항-TFAM 항체. Alexa Fluor 488(1:400)과 접합된 anti-TOMM20 항체로 동일한 수의 세포를 30분 동안 별도로 염색합니다(15mL 튜브에 1차 항체 용액 1mL, 항체에 대한 자세한 내용은 재료 표 참조).
- 세포를 PBS(1x)로 한 번 세척하고 300× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. NDUFB10, SDHA 및 COX IV의 튜브에 2차 항체(1:400)를 추가하고 이러한 용액으로 세포를 30분 동안 배양합니다.
- 세포를 PBS(1x)로 300×g에서 5 분 동안 원 심분리하여 한 번 세척합니다. 상청액을 흡인하여 튜브에 약 100μL를 남깁니다. 세포 펠릿을 300μL의 PBS(1x)에 재현탁시킨다. 얼음 위의 어두운 곳에 보관된 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 세포를 옮깁니다.
- 유세포 분석기에서 세포를 분석합니다 (3 개의 파란색 및 1 개의 빨간색 레이저 구성). 530/30 대역통과 필터를 사용하여 필터 1(FL1)에서 신호를 검출합니다. 현미경 설정 및 매개변수에 대해서는 보충 그림 S2 를 참조하십시오.
5. 유세포 분석 획득 및 분석
- 염색되지 않은 컨트롤 튜브를 사용하여 분석된 세포 집단의 크기와 복잡성을 기반으로 전방 산란 영역(FSC-A) 및 측면 산란 영역(SSC-A) 산점도를 설정합니다. 현미경 설정 및 매개변수에 대해서는 보충 그림 S2 를 참조하십시오.
참고: 개별 세포 유형에 대해 염색되지 않은 컨트롤을 설정합니다. - 비염색 제어 튜브를 사용하여 포지티브 게이트를 선택하고 단색 제어 튜브를 사용하여 다색 유세포분석에서 MTG(형광단-1[FL-1])와 TMRE(FL-2) 간의 형광 스펙트럼 중첩을 보정합니다. 음성 대조군에 이소타입 제어를 사용하여 MRC 및 TFAM 샘플의 배경 염색을 모니터링합니다. FCCP 튜브를 TMRE 염색을 위한 탈분극 제어로 사용하십시오.
- 외부 파편을 차단하여 전방 및 측면 산점도에서 살아있는 세포와 주 게이팅을 선택합니다(그림 2A). 전방 산란 높이(FSC-H) 대 FSC-A 밀도 플롯을 사용하여 이중선을 게이트 아웃하여 더블릿을 제외하고 측면 산란 높이(SSC-H) 대 SSC-A 플롯을 구성합니다(그림 2A).
- 데이터 수집(유세포분석기)
- 염색되지 않은 또는 이소타입 샘플을 음성 대조군으로 사용하여 SSC-A 및 다양한 필터(FL1, FL2, FL3, FL4)를 보면서 단일 세포 이벤트의 주요 집단 위에 게이트를 만듭니다(그림 1B 및 그림 2B).
- 데이터 분석 (CFlow 소프트웨어)
- 게이트의 위치를 염색된 세포 샘플 상에 복사하고, 양성 염색을 위해 양성으로 염색된 세포의 양을 기록한다.
- 각 세포 부분모집단에 대해 히스토그램 플롯을 선택하고 다양한 필터 채널(FL1, FL2, FL3, FL4)(x축)의 중간 형광 강도(MFI)를 분석합니다.
- 아래의 식 (1)과 같이 히스토그램의 #3 TMRE 염색 샘플에서 FL2의 MFI로부터 #2 FCCP 처리된 세포의 FL2의 MFI를 빼서 TMRE 수준을 계산한다.
TMRE 수준 = #3 TMRE-염색된 샘플에서 추출한 FL2의 MFI - #2 FCCP 처리된 세포의 FL2의 MFI (1) - MMP 및 미토콘드리아 ROS에 대한 특정 값을 TMRE 또는 MitoSox Red에서 MFI로 계산하여 미토콘드리아 부피 지시지 MTG로 나눕니다.
- 복소수 표현식 또는 TFAM에서 MFI를 사용하여 복소 서브유닛 및 TFAM에 대한 특정 값을 계산하고 미토콘드리아 부피 지표 TOMM20을 나눕니다.
- 아래의 식 (1)과 같이 히스토그램의 #3 TMRE 염색 샘플에서 FL2의 MFI로부터 #2 FCCP 처리된 세포의 FL2의 MFI를 빼서 TMRE 수준을 계산한다.
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Representative Results
분화 방법 및 유세포 분석 전략에 대한 개략적인 설명이 그림 3에 나와 있습니다. 인간 iPSC는 신경 로제트로 분화된 다음 신경 영역으로 분화하기 위해 서스펜션 배양으로 들어 올려집니다. 신경 영역은 DA 뉴런으로 더욱 분화되고 성숙됩니다. 신경 구체는 단일 세포로 해리되어 신경교 성상 세포를 생성하고 NSC로 단층으로 재 도금 된 다음 성상 세포로 분화됩니다. 이 프로토콜은 MMP, 미토콘드리아 부피, 미토콘드리아 ROS 수준, MRC 복합체 서브유닛의 발현 수준 및 TFAM(상대적 mtDNA 복제 수의 간접 측정)을 측정하기 위해 유세포분석으로 샘플을 획득하고 분석하는 데 필요한 전략을 제공합니다. 구체적으로, 형광 리포터, TMRE 및 MTG와의 동시 염색을 사용하여 MMP 및 미토콘드리아 부피의 변화를 검출하고 정량화했습니다. MitoSox Red 및 MTG와의 동시 염색을 통해 살아있는 세포에서 미토콘드리아 ROS 생성을 측정할 수 있습니다. TOMM20과 함께 MRC 복합체 서브유닛에 대한 항체로 염색하면 mtDNA 복제 수의 간접 평가를 위해 MRC를 평가하고 TFAM 및 TOMM20을 염색할 수 있습니다. 중요한 것은 MTG와 TOMM20이 미토콘드리아 부피당 측정을 가능하게 하여 이러한 매개변수에 대한 미토콘드리아 부피의 영향을 상쇄한다는 것입니다.
DA 뉴런은 이중 SMAD 억제를 통해 iPSC로부터 생성되고 도 4A에 도시된 바와 같이, FGF-8b 및 소닉 헤지혹(SHH) 작용제 PM에 노출된다. 인간 iPSC는 매트릭스 코팅 플레이트의 iPSC 배양 배지에 시딩됩니다. 세포가 50%-80% 컨플루언시에 도달하면 배지는 SB431542, AMPK 억제제, 화합물 C 및 N-아세틸시스테인이 보충된 CDM을 사용하여 NIM으로 5일 동안 변경됩니다. 5일 후, iPSC(그림 4B, a)는 명확한 신경 로제트 구조(그림 4B, b)를 나타내는 신경 상피 단계로 진행됩니다. 5일째에 신경 상피를 현탁 배양으로 들어 올리고 인큐베이터 내부의 오비탈 셰이커의 NSC SF 배지에서 배양하여 신경구를 생성합니다. 둥글고 잘 정의된 구체가 그림 4B, c에 나와 있습니다. 7일째에 배지를 100ng/mL FGF-8b가 보충된 CDM으로 변경합니다. 14일째에 배지는 100ng/mL FGF-8b 및 1μM PM이 보충된 CDM으로 변경됩니다. 21일째에 구체는 단세포로 해리하고 PLO 및 라미닌 코팅 플레이트/커버슬립에 10ng/mL BDNF 및 10ng/mL GDNF가 보충된 CDM에서 배양함으로써 단층의 DA 뉴런으로 해리됩니다. 15-30일 동안 성숙된 뉴런(도 4B, e)은 미토콘드리아 기능 측정에 추가로 사용된다.
NSC는 신경 구체를 단일 세포로 해리 한 다음 단층으로 재 도금하여 성상 세포를 생성하여 생성됩니다. 이 NSC는 고전적인 신경 전구 모양을 보여줍니다 (그림 4B, d). 이 단계의 NSC는 추가 사용을 위해 쉽게 확장 및 은행에 보관할 수 있습니다. 성상 세포 분화를 시작하기 위해 NSC는 NSC SF 배지의 PDL 코팅 커버 슬립에 도금됩니다. 다음날, 배지는 28 일 동안 성상 세포 분화 배지로 변경됩니다. 28일 후, 분화된 성상교세포는 성상세포 성숙 배지에서 추가로 성숙된다. 이 단계에서 성상 세포는 별 모양의 형태를 나타내야하며 (그림 4B, f), 이러한 세포는 미토콘드리아 기능 평가를 포함하여 추가 사용을 위해 확장 및 은행에 보관 될 수 있습니다.
분화 동안, 세포 동일성은 면역 형광 염색을 사용하여 확인된다. 도 5A에서, 면역염색은 iPSCs가 특이적 다능성 마커인 SSEA4 및 Oct4를 발현한다는 것을 보여준다. 그림 5B는 신경구가 Nestin 및 Pax6의 양성 염색을 나타내는 반면, 그림 5C 는 단층의 iPSC 유래 NSC 가 Nestin 및 Sox2의 양성 염색을 나타내는 것을 보여줍니다. DA 뉴런을 확인하기 위해, 세포는 신경 마커 β III 튜불린 (Tuj 1) 및 DA 뉴런 마커 티로신 하이드록실라제 (TH)로 염색된다(도 6B). 또한 DA 뉴런은 시냅스 마커, 시냅토피신 및 PSD-95에 대한 염색을 보여 기능적 시냅스 연결을 확인합니다(그림 5B). iPSC 유래 성상교세포의 면역염색은 성상세포 마커인 신경교세포섬유산단백질(GFAP) 및 S100 칼슘 결합 단백질 β(S100β)의 발현을 나타낸다.
유세포 분석을 사용하여 분화 된 뉴런 및 성상 세포에서 미토콘드리아 기능의 조사는 프로토콜 섹션 3 및 4에서 전술 한 바와 같이 수행된다. 그림 1B와 같이 데이터 수집에는 유세포분석기를, 데이터 분석에는 CFlow 샘플러를 사용했습니다.
그림 2는 살아있는 단일 셀을 게이팅하는 방법을 보여줍니다. 죽은 세포 및 세포 파편은 FSC 대 SSC 플롯을 사용하여 제외됩니다 (그림 2A, a). 셀 더블릿은 FSC-H 대 FSC-A 플롯(그림 2A, b)과 SSC-H 대 SSC-A 플롯(그림 2A, c)을 사용하여 제외됩니다. 배경 형광은 특정 세포 유형의 음성 집단이 동일한 세포 유형 내의 양성 집단과 비교되는 경우 적절하게 평가됩니다(그림 2B, a). MMP 샘플의 경우 FCCP로 세포를 처리하면 미토콘드리아 막 전위 및 TMRE 염색의 간섭이 제거됩니다 (그림 2B, b).
이러한 유세포 분석 접근법은 미토콘드리아 DNA 중합 효소 인 POLG (W748S)의 촉매 서브 유닛에서 돌연변이를 운반하는 인간 iPSC에서 생성 된 DA 뉴런을 연구하고 디트로이트 551 섬유 아세포에서 생성 된 무병 샘플과 비교하는 데 사용되었습니다. 이전에 보고된 바와 같이4, 이 연구는 또한 POLG DA 뉴런에서 MMP 감소와 특정 미토콘드리아 ROS 수준 증가를 입증했습니다(그림 7). 그러나, 미토콘드리아 부피, 총 MMP, 및 총 미토콘드리아 ROS 수준은 변하지 않았다. 도 8에서, 결과는 대조군과 비교하여 돌연변이 DA 뉴런에서 특이적 콤플렉스 I 수준의 감소, 더 낮은 총 및 특이적 TFAM 수준, 그러나 유사한 특이적 콤플렉스 II 수준을 보여준다.
이 접근법은 동일한 iPSC 라인에서 생성 된 성상 세포를 연구하는 데에도 사용되었습니다. 이전에 보고된 바와 같이 도7 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 결과는 POLG-돌연변이된 성상교세포가 대조군과 비교하여 총 및 특이적 MMP는 낮았지만 미토콘드리아 부피 및 미토콘드리아 ROS는 유사할 뿐만 아니라 특정 복합체 I 및 IV의 수준이 감소했음을 보여준다(도 10). 그러나, 복합체 I 및 IV의 총 수준에는 변화가 없었고 POLG 성상 세포에서 복합체 II의 전체 및 특정 수준에는 변화가 없었다. 전반적으로, 이러한 데이터는 여러 미토콘드리아 파라미터의 유세포 분석 분석이 iPSC 및 신경 및 신경교 유도체와 같은 세포에서 미토콘드리아 기능을 평가하는 데 유용한 첫 번째 단계 근사치를 제공한다는 것을 시사합니다.
그림 1: 유세포분석을 위한 설정. (a) MMP, 미토콘드리아 부피, 및 미토콘드리아 ROS 염색; (b) C6 유세포분석기에서의 데이터 수집의 예. 약어: MMP = 미토콘드리아 막 전위; ROS = 활성 산소종; FCCP = 카르보닐 시안화물 p-트리플루오로메톡시페닐히드라존; TMRE = 테트라메틸로다민 에틸 에스테르; MTG = 미토 트래커 그린. 또한 보충 표 S2를 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 게이팅 전략. (A) 데이터 수집; (b) 살아있는 세포에서 MTG 및 TMRE 염색을 사용한 형광의 히스토그램. 약어 : SSC-A = 측면 산란 영역; FSC-A = 전방 산란 영역; SSC-H = 측면 산란 높이; FSC-H = 전방 산란 높이; FL#-A = 형광단 # 면적; MTG = 미토 트래커 그린; FCCP = 카르보닐 시안화물 p-트리플루오로메톡시페닐히드라존; TMRE = 테트라 메틸로 다민 에틸 에스테르. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 프로토콜 워크플로의 도식적 표현. 약어 : DA = 도파민 성; MMP = 미토콘드리아 막 전위; ROS = 활성 산소종; NDUFB 10 = NADH : 유비 퀴논 산화 환원 효소 서브 유닛 10; SDHA = 숙시네이트 탈수소효소 복합체 플라보단백질 서브유닛 A; COX IV = 시토크롬 c 옥시다아제 복합체 IV; mtDNA = 미토콘드리아 DNA; TFAM = 미토콘드리아 전사 인자 A. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: iPSC 분화. (A) 순서도 및 (B) iPSCs(a), 신경 로제트(b), 신경구(c), NSC(d), DA 뉴런(e) 및 성상교세포(f)를 포함하는 분화 동안 상이한 단계로부터의 세포에 대한 대표 이미지. 스케일 바 = 25 μm. 약어 : iPSC = 유도 만능 줄기 세포; NSC = 신경 줄기 세포; DA = 도파민성; SFM = 무혈청 배지; CDM = 화학적으로 정의된 매질; FGF-8b = 섬유아세포 성장 인자-8b; PM = 푸르모르파민; BDNF = 뇌 유래 신경 영양 인자; GDNF = 신경교세포주 유래 신경영양인자; PLO = 폴리 -L- 오르니 틴. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: iPSC와 그 신경 유도체의 대표적인 컨포칼 이미지. (A) iPSC에서 SSEA4 (빨간색) 및 Oct4 (녹색)의 면역 염색. (B) iPSC 유래 뉴런 구체에서 네스틴(적색) 및 Pax6(녹색)의 면역염색. (C) iPSC 유래 NSC에서 네스틴(적색) 및 Sox2(녹색)의 면역염색. 핵은 DAPI(청색)로 염색된다. 스케일 바 = 50 μm. 약어 : iPSC = 유도 만능 줄기 세포; NSC = 신경 줄기 세포; SSEA4 = 단계 특이적 배아 항원-4; Oct4 = 옥타머 결합 전사 인자 4; Pax6 = 페어링된 상자-6; Sox2 = 성별 결정 영역 Y 상자-2; DAPI = 4',6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: iPSC 유래 성상세포와 DA 뉴런의 대표적인 컨포칼 이미지. (A) iPSC 유래 성상세포에서 GFAP(적색) 및 S100β(녹색)의 면역염색. (B) iPSC 유래 DA 뉴런에서 신경 계통 마커 TH (녹색), Tuj 1 (빨간색) 및 신경 기능 마커 Synaptophysin (녹색) 및 PSD-95 (빨간색)의 면역 염색. 핵은 DAPI(파란색)로 염색됩니다. 스케일 바 = 25 μm. 약어 : iPSC = 유도 만능 줄기 세포; GFAP = 신경교 섬유 산성 단백질; S100β = S100 칼슘-결합 단백질 β; Tuj 1 = β III 튜불린; PSD-95 = 시냅스 후 밀도 단백질 95; DA = 도파민성; DAPI = 4',6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: POLG 환자 iPSC의 클론 1개 및 디트로이트 551 대조군 iPSC의 클론 1개에서 유래된 DA 뉴런에 대한 유세포 분석 분석. (A) MTG로 측정한 미토콘드리아 부피, (B) TMRE로 측정한 총 MMP, (C) 총 TMRE/MTG로 계산한 특정 MMP 수준, (D) MitoSox Red로 측정한 총 미토콘드리아 ROS, 및 (E ) 특정 미토콘드리아 ROS 수준은 총 MitoSox Red/MTG에 의해 계산되었습니다. 데이터는 샘플 수(클론당 n ≥ 3개)에 대한 평균(SEM)의 평균 ± 표준 오차로서 제시되었다. 데이터는 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 분석 및 생성되었습니다. Mann-Whitney U 검정은 변수에 대한 통계적 유의성을 평가하는 데 사용되었습니다. 유의성은 P < 0.05에 대해 표시됩니다. *P < 0.05; NS, 중요하지 않습니다. 약어 : DA = 도파민 성; POLG = DNA 중합효소 서브유닛 감마; iPSCs = 유도 만능 줄기 세포; MMP = 미토콘드리아 막 전위; ROS = 활성 산소종; MTG = 미토 트래커 그린; TMRE = 테트라 메틸로 다민 에틸 에스테르. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8: POLG 환자 iPSC의 클론 1개 및 디트로이트 551 대조군 iPSC의 클론 1개로부터 유래된 성상교세포에 대한 유세포 분석 분석. (A) MTG로 측정한 미토콘드리아 부피, (B) TMRE로 측정한 총 MMP, (C) 총 TMRE/MTG로 계산한 특정 MMP 수준, (D) MitoSox Red로 측정한 총 미토콘드리아 ROS S 및 (E ) 특정 미토콘드리아 ROS 수준은 총 MitoSox Red/MTG에 의해 계산되었습니다. 데이터는 샘플 수(클론당 n ≥ 3개)에 대한 평균(SEM)의 평균 ± 표준 오차로서 제시되었다. 데이터는 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 분석 및 생성되었습니다. Mann-Whitney U 검정은 변수에 대한 통계적 유의성을 평가하는 데 사용되었습니다. 유의성은 P < 0.05에 대해 표시됩니다. *P < 0.05; NS, 중요하지 않습니다. 약어 : POLG = DNA 중합 효소 서브 유닛 감마; iPSC = 유도 만능 줄기 세포; MMP = 미토콘드리아 막 전위; ROS = 활성 산소종; MTG = 미토 트래커 그린; TMRE = 테트라 메틸로 다민 에틸 에스테르. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: POLG 환자 iPSC의 클론 1개와 디트로이트 551 대조군 iPSC의 클론 1개에서 유래한 DA 뉴런에 대한 유세포 분석 분석. (A) NDUFB10에 의해 측정된 총 복합체 I, (B) 총 NDUFB10/TOMM20에 의해 계산된 특정 복합체 I 레벨, (C) SDHA에 의해 측정된 총 복합체 II, (D) 총 SDHA/TOMM20에 의해 계산된 특정 콤플렉스 II 레벨, (E) TFAM에 의해 측정된 총 TFAM 및 (F) 총 TFAM/TOMM20에 의해 계산된 특정 TFAM 레벨. 데이터는 샘플 수에 대한 평균(SEM)의 평균± 표준 오차로서 제시되었다(클론 당 n ≥ 3). 데이터는 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 분석 및 생성되었습니다. 변수에 대한 통계적 유의성을 평가하는 데 사용되는 Mann-Whitney U 검정. 유의성은 P < 0.05에 대해 표시됩니다. *P < 0.05; NS, 중요하지 않습니다. 약어 : DA = 도파민 성; POLG = DNA 중합효소 서브유닛 감마; iPSC = 유도 만능 줄기 세포; NDUFB10 = NADH: 유비퀴논 산화환원효소 서브유닛 10; TOMM20 = 미토콘드리아 외막 20의 트랜스로카제; SDHA = 숙시네이트 탈수소효소 복합체 플라보단백질 서브유닛 A; TFAM = 미토콘드리아 전사 인자 A. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 10: POLG 환자 iPSC의 클론 1개 및 디트로이트 551 대조군 iPSC의 클론 1개로부터 유래된 성상교세포에 대한 유세포 분석 분석. (A) NDUFB10에 의해 측정된 총 복합체 I, (B) 총 NDUFB10/TOMM20에 의해 계산된 특정 복합체 I 수준, (C) SDHA에 의해 측정된 총 복합체 II, (D) 총 SDHA/TOMM20에 의해 계산된 특정 복합체 II 수준, (E) COX IV에 의해 측정된 총 복합체 IV, (F) COX IV/TOMM20에 의해 계산된 특정 복합체 IV 수준, (G) TFAM에 의해 측정된 총 TFAM 및 (H) 총 TFAM/TOMM20에 의해 계산된 특정 TFAM 수준. 데이터는 샘플 수에 대한 평균(SEM)의 평균± 표준 오차로서 제시되었다(클론 당 n ≥ 3). 데이터는 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 분석 및 생성되었습니다. Mann-Whitney U 검정은 변수에 대한 통계적 유의성을 평가하는 데 사용되었습니다. 유의성은 P < 0.05에 대해 표시됩니다. *P < 0.05; ** P < 0.01; NS, 중요하지 않습니다. 약어 : POLG = DNA 중합 효소 서브 유닛 감마; iPSC = 유도 만능 줄기 세포; NDUFB10 = NADH: 유비퀴논 산화환원효소 서브유닛 10; TOMM20 = 미토콘드리아 외막 20의 트랜스로카제; SDHA = 숙시네이트 탈수소효소 복합체 플라보단백질 서브유닛 A; TFAM = 미토콘드리아 전사 인자 A; COX IV = 시토크롬 c 산화 효소 복합체 IV. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1: 컨포칼 레이저 스캐닝 형광 현미경의 설정 및 이미지 촬영 단계. (A) 구성 도구를 선택하고 현재 사용 가능한 레이저에서 올바른 레이저 유형을 선택하고 출력을 설정합니다. (B) 획득- 획득 모드-SEQ 를 선택하고 데이터베이스에서 해당 형광 파장 사진 모드를 선택합니다. (C) 순차 스캔로드 를 선택하고 해당 모드를 가져옵니다. (D) 40x 대물 렌즈를 선택하고 드롭하여 추가합니다. (E) 다른 파장에서 사진을 찍기위한 특정 설정 매개 변수. (F) 사진 매개 변수를 설정하고 사진을 미리보고 저장합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S2: 유세포분석을 위한 단계 및 설정. (ᅡ) Cflow 소프트웨어를 열고 파일 도구를 선택한 다음 CFlow 파일 또는 템플릿 열기를 선택합니다. (B) 40000개의 이벤트를 설정하고 Run Limits(실행 제한) 패널에서 라이브 단일 셀만 포함하는 게이트를 선택합니다. 유체 패널에서 중간 속도를 선택합니다. (C) 기본 게이팅을 설정하기 위해 FSC-A 대 FSC-A 플롯 (a)를 선택합니다. 이중항을 제외하려면 FSC-A 대 FSC-H 플롯(b) 및 SSC-A 대 SSC-H 플롯(c)을 선택합니다. FL1 또는 FL2와 같은 해당 필터를 선택하고 염색되지 않은 세포를 실행할 때 FL1-A 대 FSC-A 플롯(d) 또는 FL2-A 대 FSC-A 플롯을 사용하여 양성 이벤트를 그립니다. (D) 동일한 매개 변수를 설정하고, 미리보고, 염색 된 샘플을 실행하고 사진을 저장합니다. 또한 보충 표 S2를 참조하십시오. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S1: 미디어 및 솔루션 레시피. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 S2: 유세포 분석 염색을 위한 설정. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본원에는 iPSC 유래 뉴런 및 성상세포를 생성하고 유세포분석을 사용하여 미토콘드리아 기능의 여러 측면을 평가하기 위한 프로토콜이 있습니다. 이러한 프로토콜을 통해 인간 iPSC를 뉴런과 신경교 성상 세포로 효율적으로 변환하고 대부분 살아있는 세포에서 미토콘드리아 기능을 자세히 특성화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 살아있는 세포의 부피, MMP 및 미토콘드리아 ROS 수준과 고정 세포의 MRC 복합체 및 TFAM을 포함한 여러 미토콘드리아 기능을 획득하고 분석하기 위한 공동 염색 유세포분석 기반 전략을 제공합니다. 특히, 이러한 프로토콜은 미토콘드리아 부피 당 전체 및 특정 수준의 추정을 허용합니다. 이 전략은 DA 뉴런 및 성상 세포에서 알려진 미토콘드리아 질환 (POLG)에서 미토콘드리아 기능 장애를 감지하지만 이러한 기술은 모든 유형의 세포 및 질병에 적용 할 수 있습니다. 또한 프로토콜은 강력하고 재현 가능합니다. 이전의 여러 연구에서는 섬유 아세포, iPSC, NSC, DA 뉴런 및 성상 세포 2,3,13,17의 미토콘드리아 변화를 분석하기 위해이 프로토콜을 성공적으로 적용했습니다.
이 프로토콜을 실행하는 동안 고려해야 할 몇 가지 중요한 사항이 있습니다. 일관되고 고효율의 분화를 보장하려면 고품질 iPSC(<5% 분화된 세포를 포함하는 세포)로 전환을 시작하는 것이 중요합니다. 상업적으로 이용 가능한 다른 정의 된 매체가 유효한 대안이 될 수 있지만,이 연구는 대안을 다루지 않았다. iPSC 라인의 배지 조성 및 클론 차이는 시작 세포 집단의 증식과 분화 효율성 모두에 영향을 미칠 수 있으므로 이 프로토콜을 다른 유지 배지에 적용하려면 최적화가 필요할 수 있습니다.
MTG와 MMP 형광의 관계는 이전에 연구되었습니다3. 이는 MTG 형광이18과 무관하고 MMP 19,20에 민감한 것으로 보고되기 때문에 중요합니다. iPSC를 다른 농도의 TMRE로 적정하고 150nM MTG로 공동 염색한 이전 연구에서 MTG 수준은 더 낮은 농도의 TMRE(5-100nM)에서 동일하게 유지된 반면, 더 높은 TMRE 농도(100nM 이상)에서는 감소된 MTG 신호가 관찰되었습니다. 따라서, 100 nM TMRE 및 150 nM MTG가 특정 MMP를 측정하기 위해 선택되었다. 이러한 관계는 세포 특이적일 수 있으므로, MMP를 측정하기 위해 MTG 및 TMRE 이중 염색을 사용하기 전에 MTG와 MMP 형광 사이의 상관관계를 평가해야 한다.
세포 밀도는 또한 미토콘드리아 기능과 세포 대사에 영향을 줄 수 있습니다. 이 연구에서, MMP의 세포 밀도 의존적 변화가 관찰되었으며, 이는 다른 연구21에서도 나타났다. 따라서, 상이한 세포 유형에 대한 공동염색 프로토콜을 확립할 때 변동을 최소화하기 위해 너무 높거나 낮지 않은 모든 샘플에서 유사한 세포 밀도를 선택하는 것이 중요하다. 다른 현미경 기반 분석과 비교하여 유세포분석은 많은 수의 세포를 분석할 때 속도와 재현성의 장점이 있습니다. 현미경 이미지 분석에서 연구자의 편향은 결과를 어느 정도 왜곡하므로 유세포 분석을 사용할 때 문제가되지 않습니다. 또한 유세포 분석 분석에는 백만 개 미만의 세포가 필요하며 하나의 샘플을 분석하는 데 몇 분 밖에 걸리지 않으므로 1-2 시간 내에 수십 개의 샘플을 분석 할 수 있습니다. 이 기술은 또한 다른 신경 퇴행성 질환의 세포 유형을 포함하여 다양한 세포 유형에 적용될 수 있으므로 다른 신경 퇴행성 질환에서 메커니즘을 이해하고 잠재적 인 치료법을 테스트하는 데 유용해야합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
노르웨이 베르겐 대학교의 분자 이미징 센터와 유세포 분석 핵심 시설에 감사드립니다. 이 연구는 노르웨이 연구위원회 (보조금 번호 : 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat 및 중국 장학위원회 (프로젝트 번호 : 201906220275)의 자금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-Oct4 | Abcam | ab19857, RRID:AB_445175 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-SSEA4 | Abcam | ab16287, RRID:AB_778073 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-Sox2 | Abcam | ab97959, RRID:AB_2341193 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Pax6 | Abcam | ab5790, RRID:AB_305110 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Nestin | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927, RRID:AB_627994 | Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-GFAP | Abcam | ab4674, RRID:AB_304558 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
| anti-S100β conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab196442, RRID:AB_2722596 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; |
| anti-TH | Abcam | ab75875, RRID:AB_1310786 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Tuj 1 | Abcam | ab78078, RRID:AB_2256751 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-Synaptophysin | Abcam | ab32127, RRID:AB_2286949 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-PSD-95 | Abcam | ab2723, RRID:AB_303248 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
| anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab198308 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
| anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488 | Santa Cruz Biotechnology | Cat# sc-17764 RRID:AB_628381 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
| anti-NDUFB10 | Abcam | ab196019 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
| anti-SDHA | Abcam | ab137040 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
| anti-COX IV | Abcam | ab14744, RRID:AB_301443 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control. |
| Activin A | PeproTech | 120-14E | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| ABM Basal Medium | Lonza | CC-3187 | Basal medium for astrocyte culture |
| AGM SingleQuots Supplement Pack | Lonza | CC-4123 | Supplement for astrocyte culture |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | CDM ingredient |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Basal medium for dilute Geltrex |
| Bovine Serum Albumin | Europa Bioproducts | EQBAH62-1000 | Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | DA neurons medium ingredient |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer | BD Biosciences, USA | ||
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermo Fisher Scientific | 11905031 | CDM ingredient |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G | Leica Microsystems, Germany | ||
| Corning non-treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430589 | Suspension culture |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Used for a variety of cell culture wash |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565018 | Astrocyte differentiation basal Medium |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| Essential 8 Basal Medium | Thermo Fisher Scientific | A1516901 | Basal medium for iPSC culture |
| Essential 8 Supplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Supplement for iPSC culture |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0314 | Supplement for NSC culture |
| FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Supplement for NSC culture |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12103C | Medium ingredient |
| FGF-basic | PeproTech | 100-18B | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| FCCP | Abcam | ab120081 | Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining |
| Fluid aspiration system BVC control | Vacuubrand, Germany | ||
| Formaldehyde (PFA) 16% | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Cell fixation |
| Geltrex | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Used for attachment and maintenance of human iPSCs |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Supplement for NSC culture |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | DA neurons medium ingredient |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Used for blocking buffer |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31765027 | Basal medium for CDM |
| Heregulin beta-1 human | Sigma-Aldrich | SRP3055 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H1399 | Stain the nuclei for confocal image |
| Heracell 150i CO2 Incubators | Fisher Scientific, USA | ||
| IMDM | Thermo Fisher Scientific | 21980032 | Basal medium for CDM |
| Insulin | Roche | 1376497 | CDM ingredient |
| InSolution AMPK Inhibitor | Sigma-Aldrich | 171261 | Neural induction medium ingredient |
| Insulin-like Growth Factor-I human | Sigma-Aldrich | I3769 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| KnockOut DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Basal medium for NSC culture |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | ||
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | CDM ingredient |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | Used for mitochondrial volume indicator |
| MitoSox Red | Thermo Fisher Scientific | M36008 | Used for mitochondrial ROS indicator |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | Neural induction medium ingredient |
| N-2 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Used for blocking buffer |
| Orbital shakers - SSM1 | Stuart Equipment, UK | ||
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7405 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Purmorphamine | STEMCELL Technologies | 72204 | Promotes DA neuron differentiation |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting the coverslip for confocal image |
| PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | Used for a variety of wash |
| Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein | R&D Systems | 423-F8-025/CF | Promotes DA neuron differentiation |
| SB 431542 | Tocris Bioscience | TB1614-GMP | Neural Induction Medium ingredient |
| StemPro Neural Supplement | Thermo Fisher Scientific | A10508-01 | Supplement for NSCs culture |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Cell dissociation reagent |
| Transferrin | Roche | 652202 | CDM ingredient |
| TRITON X-100 | VWR International | 9002-93-1 | Used for cells permeabilization in immunostaining assays |
| TMRE | Abcam | ab113852 | Used for mitochondrial membrane potential staining |
| Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments | Grant Instruments, USA |
References
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