Economisch en efficiënt protocol voor het isoleren en kweken van beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen
Summary
Hier presenteren we een economische en efficiënte methode om zeer zuivere beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen te isoleren en te genereren na 7 dagen cultuur met 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.
Abstract
De vraag naar dendritische cellen (DC’s) neemt geleidelijk toe naarmate het immunologisch onderzoek vordert. DC’s zijn echter zeldzaam in alle weefsels. De traditionele methode voor het isoleren van DC’s omvat voornamelijk het induceren van beenmerg (BM) differentiatie in DC’s door het injecteren van grote doses (>10 ng / ml) granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor / interleukine-4 (GM-CSF / IL-4), waardoor de procedure complex en duur wordt. In dit protocol werden, met behulp van alle BM-cellen gekweekt in 10 ng / ml GM-CSF / IL-4 medium, na 3-4 halve cultuuruitwisselingen, tot 2,7 x 107 CD11c + cellen (DC’s) per muis (twee dijbenen) geoogst met een zuiverheid van 80% -95%. Na 10 dagen in cultuur nam de expressie van CD11c, CD80 en MHC II toe, terwijl het aantal cellen afnam. Het aantal cellen piekte na 7 dagen kweek. Bovendien duurde deze methode slechts 10 minuten om alle beenmergcellen te oogsten en werd een groot aantal DC’s verkregen na 1 week cultuur.
Introduction
Dendritische cellen (DC’s) zijn de krachtigste antigeen-presenterende cellen (APC’s) voor het activeren van naïeve T-cellen en het induceren van specifieke cytotoxische T-lymfocyten (CTL) reacties tegen infectieziekten, allergieziekten en tumorcellen 1,2,3. DC’s zijn de primaire schakel tussen aangeboren immuniteit en adaptieve immuniteit en spelen een essentiële rol in immunologische afweer en het behoud van immuuntolerantie. In de afgelopen 40 jaar hebben veel onderzoekers geprobeerd de subsets van DC’s en hun functies in ontsteking en immuniteit te definiëren. Volgens die studies ontwikkelen DC’s zich langs de myeloïde en lymfoïde afstammingslijnen van beenmergcellen. Tumorvaccins hebben de afgelopen jaren belangrijke mijlpalen bereikt en hebben een veelbelovende toekomst. Mechanisch moduleren tumorvaccins de immuunrespons en voorkomen tumorgroei door cytotoxische T-lymfocyten te activeren met behulp van tumorantigenen. Het vaccin op basis van DC’s speelt een belangrijke rol in tumorimmunotherapie en is geïdentificeerd als een van de meest veelbelovende antitumortherapieën 1,4. Bovendien zijn DC’s op grote schaal gebruikt bij het testen van nieuwe moleculair gerichte geneesmiddelen en immuuncheckpointremmers5.
Onderzoekers hebben dringend een groot aantal zeer zuivere DC’s nodig om de rol van DC’s verder te bestuderen. DC’s zijn echter zeldzaam in verschillende weefsels en bloed, goed voor slechts 1% van de bloedcellen bij mens en dier. In vitro kweek van beenmerg dendritische cellen (BMDC) is een belangrijke methode voor het verkrijgen van grote hoeveelheden DC-cellen. Ondertussen is het Lutz-protocol voor het genereren van DC’s uit beenmerg veel gebruikt door onderzoekers6. Hoewel het protocol effectief is bij het verkrijgen van DC-cellen, is het complex en duur, waarbij hoge concentraties cytokines en de lysis van rode bloedcellen worden toegevoegd.
In deze studie rapporteren we een methode voor het isoleren van bijna alle beenmergcellen uit het beenmerg van muizen (BM) en het induceren van differentiatie in BMDC na 7-9 dagen incubatie in vitro, met een lagere concentratie GM-CSF en IL-4. Deze procedure duurt slechts 10 minuten om bijna alle beenmergcellen te oogsten en in een volledig medium op te hangen. Kortom, we bieden in dit onderzoek een efficiënte en kosteneffectieve kweekmethode voor BMDC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mensen en muizen hebben verschillende DC-subsets, waaronder klassieke DC’s (cDC’s, inclusief cDC1’s en cDC2’s), plasmacytoïde DC’s (pDC’s) en monocyten-afgeleide DC’s (MoDC’s)9,10,11. Het is algemeen aanvaard dat cDC1’s cytotoxische T-lymfocyten (CTL) -reacties op intracellulaire pathogenen en kanker reguleren, en cDC2’s reguleren immuunresponsen op extracellulaire pathogenen, parasieten en allergenen12….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Tianjin Science and Technology Plan (20JCQNJC00550), Tianjin Health Science and Technology Project (TJWJ202021QN033 en TJWJ202021QN034).
Materials
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
References
- Huang, M. N., et al. Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).
- Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo. Biomaterials. 182, 92-103 (2018).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Jiang, P. L., et al. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).
- Shi, Y., et al. Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity. Frontiers in Pharmacology. 11, 566401 (2020).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Son, Y. I., et al. A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).
- Guo, L., et al. Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer. Vaccines. 9 (7), 786 (2021).
- Olweus, J., et al. Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).
- Martin, P., et al. Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors. Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions. Frontiers in Immunology. 6, 260 (2015).
- Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Mayordomo, J. I., et al. marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).
- Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).
- Brunner, G. A., et al. Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).
- Koido, S., et al. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).
- Jonasson, P. S., et al. Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle – An experimental biomechanical study. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4 (2014).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).
- Hinkel, A., et al. Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma. Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).
