بروتوكول اقتصادي وفعال لعزل وزراعة الخلايا الشجيرية المشتقة من نخاع العظم من الفئران
Summary
هنا ، نقدم طريقة اقتصادية وفعالة لعزل وتوليد خلايا تغصنية عالية النقاء مشتقة من نخاع العظام من الفئران بعد 7 أيام من الزراعة مع 10 نانوغرام / مل GM-CSF / IL-4.
Abstract
يتزايد الطلب على الخلايا المتغصنة (DCs) تدريجيا مع تقدم أبحاث علم المناعة. ومع ذلك ، فإن DCs نادرة في جميع الأنسجة. تتضمن الطريقة التقليدية لعزل DCs في المقام الأول تحفيز تمايز نخاع العظم (BM) إلى DCs عن طريق حقن جرعات كبيرة (>10 نانوغرام / مل) من عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة – البلاعم / interleukin-4 (GM-CSF / IL-4) ، مما يجعل الإجراء معقدا ومكلفا. في هذا البروتوكول ، باستخدام جميع الخلايا BM المستزرعة في وسط 10 نانوغرام / مل GM-CSF / IL-4 ، بعد 3-4 تبادلات نصف مستزرعة ، تم حصاد ما يصل إلى2.7 × 10 7 خلايا CD11c + (DCs) لكل فأر (عظم الفخذ) بنقاء 80٪ -95٪. بعد 10 أيام في الثقافة ، زاد التعبير عن CD11c و CD80 و MHC II ، في حين انخفض عدد الخلايا. بلغ عدد الخلايا ذروته بعد 7 أيام من الثقافة. علاوة على ذلك ، استغرقت هذه الطريقة 10 دقائق فقط لحصاد جميع خلايا نخاع العظم ، وتم الحصول على عدد كبير من DCs بعد أسبوع واحد من الثقافة.
Introduction
الخلايا المتغصنة (DCs) هي أقوى الخلايا التي تقدم المستضدات (APCs) لتنشيط الخلايا التائية الساذجة وتحفيز استجابات محددة للخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا (CTL) ضد الأمراض المعدية وأمراض الحساسية والخلايا السرطانية1،2،3. DCs هي الرابط الرئيسي بين المناعة الفطرية والمناعة التكيفية وتلعب دورا أساسيا في الدفاع المناعي والحفاظ على التسامح المناعي. في السنوات ال 40 الماضية ، سعى العديد من الباحثين إلى تحديد المجموعات الفرعية من DCs ووظائفها في الالتهاب والمناعة. وفقا لتلك الدراسات ، تتطور DCs على طول السلالات النخاعية واللمفاوية من خلايا نخاع العظام. اكتسبت لقاحات الأورام معالم مهمة في السنوات الأخيرة ولها مستقبل واعد. ميكانيكيا، تقوم لقاحات الأورام بتعديل الاستجابة المناعية ومنع نمو الورم عن طريق تنشيط الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا باستخدام مستضدات الورم. يلعب اللقاح القائم على DCs دورا مهما في العلاج المناعي للورم وقد تم تحديده كواحد من أكثر العلاجات المضادة للورم الواعدة 1,4. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام DCs على نطاق واسع في اختبار الأدوية الجديدة المستهدفة جزيئيا ومثبطات نقاط التفتيش المناعية5.
يحتاج الباحثون بشكل عاجل إلى عدد كبير من DCs عالية النقاء لمواصلة دراسة دور DCs. ومع ذلك ، فإن DCs نادرة في الأنسجة المختلفة والدم ، حيث تمثل 1٪ فقط من خلايا الدم في البشر والحيوانات. تعد زراعة الخلايا المتغصنة لنخاع العظم في المختبر (BMDC) طريقة مهمة للحصول على كميات كبيرة من خلايا DC. وفي الوقت نفسه ، تم استخدام بروتوكول Lutz لتوليد DCs من نخاع العظم على نطاق واسع من قبل الباحثين6. على الرغم من أن البروتوكول فعال في الحصول على خلايا DC ، إلا أنه معقد ومكلف ، حيث يتضمن إضافة تركيزات عالية من السيتوكينات وتحلل خلايا الدم الحمراء.
في هذه الدراسة ، أبلغنا عن طريقة لعزل جميع خلايا نخاع العظم تقريبا من نخاع عظم الفأر (BM) وتحفيز التمايز في BMDC بعد 7-9 أيام من الحضانة في المختبر ، مع تركيز أقل من GM-CSF و IL-4. يستغرق هذا الإجراء 10 دقائق فقط لحصاد جميع خلايا نخاع العظم تقريبا وتعليقها في وسط كامل. باختصار ، نحن نقدم طريقة زراعة فعالة وفعالة من حيث التكلفة لشركة BMDC في هذا البحث.
Protocol
Representative Results
Discussion
لدى البشر والفئران مجموعات فرعية مختلفة من DC ، بما في ذلك DCs الكلاسيكية (cDCs ، بما في ذلك cDC1s و cDC2s) و plasmacytoid DCs (pDCs) ، و DCs المشتقة من الخلية الأحادية (MoDCs) 9،10،11. من المقبول عموما أن cDC1s تنظم استجابات الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا (CTL) ل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل برنامج خطة تيانجين للعلوم والتكنولوجيا (20JCQNJC00550) ، ومشروع تيانجين للعلوم والتكنولوجيا الصحية (TJWJ202021QN033 و TJWJ202021QN034).
Materials
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
References
- Huang, M. N., et al. Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).
- Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo. Biomaterials. 182, 92-103 (2018).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Jiang, P. L., et al. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).
- Shi, Y., et al. Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity. Frontiers in Pharmacology. 11, 566401 (2020).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Son, Y. I., et al. A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).
- Guo, L., et al. Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer. Vaccines. 9 (7), 786 (2021).
- Olweus, J., et al. Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).
- Martin, P., et al. Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors. Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions. Frontiers in Immunology. 6, 260 (2015).
- Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Mayordomo, J. I., et al. marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).
- Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).
- Brunner, G. A., et al. Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).
- Koido, S., et al. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).
- Jonasson, P. S., et al. Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle – An experimental biomechanical study. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4 (2014).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).
- Hinkel, A., et al. Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma. Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).
