चूहों से अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न डेंड्राइटिक कोशिकाओं को अलग करने और खेती करने के लिए किफायती और कुशल प्रोटोकॉल
Summary
यहां, हम 10 एनजी / एमएल जीएम-सीएसएफ / आईएल -4 के साथ संस्कृति के 7 दिनों के बाद चूहों से उच्च-शुद्धता अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न डेंड्राइटिक कोशिकाओं को अलग करने और उत्पन्न करने के लिए एक किफायती और कुशल विधि प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
डेंड्राइटिक कोशिकाओं (डीसी) की मांग धीरे-धीरे बढ़ रही है क्योंकि इम्यूनोलॉजी अनुसंधान प्रगति करता है। हालांकि, डीसी सभी ऊतकों में दुर्लभ हैं। डीसी को अलग करने के लिए पारंपरिक विधि में मुख्य रूप से ग्रैनुलोसाइट्स-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक / इंटरल्यूकिन -4 (जीएम-सीएसएफ / आईएल -4) की बड़ी खुराक (>10 एनजी / एमएल) को इंजेक्ट करके डीसी में अस्थि मज्जा (बीएम) भेदभाव को प्रेरित करना शामिल है, जिससे प्रक्रिया जटिल और महंगी हो जाती है। इस प्रोटोकॉल में, 10 एनजी / एमएल जीएम-सीएसएफ / आईएल -4 माध्यम में सुसंस्कृत सभी बीएम कोशिकाओं का उपयोग करके, 3-4 अर्ध-संस्कृति एक्सचेंजों के बाद, 2.7 x 107 सीडी 11 सी + कोशिकाओं (डीसी) प्रति माउस (दो फीमर) तक 80% -95% की शुद्धता के साथ काटा गया था। संस्कृति में 10 दिनों के बाद, CD11c, CD80 और MHC II की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई, जबकि कोशिकाओं की संख्या में कमी आई। 7 दिनों की संस्कृति के बाद कोशिकाओं की संख्या चरम पर पहुंच गई। इसके अलावा, इस विधि को सभी अस्थि मज्जा कोशिकाओं की कटाई के लिए केवल 10 मिनट लगे, और संस्कृति के 1 सप्ताह के बाद डीसी की एक उच्च संख्या प्राप्त की गई।
Introduction
डेंड्राइटिक कोशिकाएं (डीसी) भोले टी कोशिकाओं को सक्रिय करने और संक्रामक रोगों, एलर्जी रोगों और ट्यूमर कोशिकाओंके खिलाफ विशिष्ट साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट (सीटीएल) प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए सबसे शक्तिशाली एंटीजन-प्रस्तुत करने वाली कोशिकाएं (एपीसी) हैं। डीसी जन्मजात प्रतिरक्षा और अनुकूली प्रतिरक्षा के बीच प्राथमिक कड़ी हैं और प्रतिरक्षाविज्ञानी रक्षा और प्रतिरक्षा सहिष्णुता के रखरखाव में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं। पिछले 40 वर्षों में, कई शोधकर्ताओं ने डीसी के सबसेट और सूजन और प्रतिरक्षा में उनके कार्यों को परिभाषित करने की मांग की है। उन अध्ययनों के अनुसार, डीसी अस्थि मज्जा कोशिकाओं से माइलॉयड और लिम्फोइड वंशों के साथ विकसित होते हैं। ट्यूमर के टीकों ने हाल के वर्षों में महत्वपूर्ण मील के पत्थर हासिल किए हैं और एक आशाजनक भविष्य है। यंत्रवत् रूप से, ट्यूमर के टीके प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को संशोधित करते हैं और ट्यूमर एंटीजन का उपयोग करके साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट्स को सक्रिय करके ट्यूमर के विकास को रोकते हैं। डीसी पर आधारित टीका ट्यूमर इम्यूनोथेरेपी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और इसे सबसे आशाजनक एंटी-ट्यूमर थेरेपी 1,4 में से एक के रूप में पहचाना गया है। इसके अलावा, डीसी का व्यापक रूप से उपयोग नई आणविक-लक्षित दवाओं और प्रतिरक्षा चेकपॉइंट अवरोधकों के परीक्षण में किया गयाहै।
शोधकर्ताओं को डीसी की भूमिका का आगे अध्ययन करने के लिए उच्च-शुद्धता डीसी की एक उच्च संख्या की तत्काल आवश्यकता होती है। हालांकि, डीसी विभिन्न ऊतकों और रक्त में दुर्लभ हैं, जो मनुष्यों और जानवरों में रक्त कोशिकाओं के केवल 1% के लिए लेखांकन करते हैं। अस्थि मज्जा डेंड्राइटिक कोशिकाओं (बीएमडीसी) की इन विट्रो संस्कृति डीसी कोशिकाओं की बड़ी मात्रा प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण विधि है। इस बीच, अस्थि मज्जा से डीसी उत्पन्न करने के लिए लुत्ज़प्रोटोकॉल का व्यापक रूप से शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग किया गया है। यद्यपि प्रोटोकॉल डीसी कोशिकाओं को प्राप्त करने में प्रभावी है, यह जटिल और महंगा है, जिसमें साइटोकिन्स की उच्च सांद्रता और लाल रक्त कोशिकाओं के लाइसिस के अलावा शामिल है।
इस अध्ययन में, हम माउस अस्थि मज्जा (बीएम) से लगभग सभी अस्थि मज्जा कोशिकाओं को अलग करने और जीएम-सीएसएफ और आईएल -4 की कम एकाग्रता के साथ विट्रो में इनक्यूबेशन के 7-9 दिनों के बाद बीएमडीसी में भेदभाव को प्रेरित करने के लिए एक विधि की रिपोर्ट करते हैं। इस प्रक्रिया में लगभग सभी अस्थि मज्जा कोशिकाओं को काटने और उन्हें एक पूर्ण माध्यम में निलंबित करने के लिए केवल 10 मिनट लगते हैं। संक्षेप में, हम इस शोध में बीएमडीसी के लिए एक कुशल और लागत प्रभावी खेती विधि प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
मनुष्यों और चूहों में शास्त्रीय डीसी (सीडीसी, सीडीसी 1 और सीडीसी 2 एस सहित) प्लाज्मासाइटोइड डीसी (पीडीसी) और मोनोसाइट-व्युत्पन्न डीसी (एमओडीसी) 9,10,11 सहित विभिन्न डीसी सबसेट होते <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को तियानजिन विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना (20JCQNJC00550), तियानजिन स्वास्थ्य विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजना (TJWJ202021QN033 और TJWJ20202021QN034) के कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
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