Økonomisk og effektiv protokoll for isolering og dyrking av benmarg-avledede dendrittiske celler fra mus

Summary

Her presenterer vi en økonomisk og effektiv metode for å isolere og generere benmarg-avledede dendrittiske celler med høy renhet fra mus etter 7 dager med kultur med 10 ng/ml GM-CSF/IL-4.

Abstract

Etterspørselen etter dendrittiske celler (DCs) øker gradvis etter hvert som immunologiforskningen utvikler seg. Imidlertid er domenekontrollere sjeldne i alle vev. Den tradisjonelle metoden for å isolere domenekontrollere innebærer først og fremst å indusere benmarg (BM) differensiering i domenekontrollere ved å injisere store doser (>10 ng/ml) granulocytt-makrofagkolonistimulerende faktor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), noe som gjør prosedyren kompleks og dyr. I denne protokollen ble bruk av alle BM-celler dyrket i 10 ng/ml GM-CSF/IL-4 medium, etter 3-4 halvkulturelle utvekslinger, opptil 2,7 x 10⁷ CD11c⁺ celler (DCer) per mus (to lårben) høstet med en renhet på 80%-95%. Etter 10 dager i kulturen økte uttrykket for CD11c, CD80 og MHC II, mens antall celler gikk ned. Antall celler toppet seg etter 7 dager med kultur. Videre tok denne metoden bare 10 minutter å høste alle benmargsceller, og et høyt antall domenekontrollere ble oppnådd etter 1 uke med kultur.

Introduction

Dendrittiske celler (DCs) er de kraftigste antigen-presenterende cellene (APCer) for å aktivere naive T-celler og indusere spesifikke cytotoksiske T-lymfocytt (CTL) responser mot smittsomme sykdommer, allergisykdommer og tumorceller ^1,2,3. Domenekontrollere er den primære koblingen mellom medfødt immunitet og adaptiv immunitet og spiller en viktig rolle i immunologisk forsvar og vedlikehold av immuntoleranse. I løpet av de siste 40 årene har mange forskere forsøkt å definere undergruppene av domenekontrollere og deres funksjoner i betennelse og immunitet. I henhold til disse studiene utvikler DCs langs myeloid og lymfoid avledninger fra benmargsceller. Tumorvaksiner har fått betydelige milepæler de siste årene og har en lovende fremtid. Mekanisk modulerer tumorvaksiner immunresponsen og forhindrer tumorvekst ved å aktivere cytotoksiske T-lymfocytter ved hjelp av tumorantigener. Vaksinen basert på domenekontrollere spiller en viktig rolle i tumorimmunoterapi og har blitt identifisert som en av de mest lovende anti-tumorterapiene ^1,4. I tillegg har domenekontrollere blitt mye brukt i testingen av nye molekylær-målrettede legemidler og immunkontrollpunkthemmere⁵.

Forskere trenger raskt et høyt antall DCer med høy renhet for å studere DCs rolle ytterligere. Imidlertid er domenekontrollere sjeldne i ulike vev og blod, og står for bare 1% av blodcellene hos mennesker og dyr. In vitro kultur av benmarg dendritiske celler (BMDC) er en viktig metode for å oppnå store mengder DC-celler. I mellomtiden har Lutz-protokollen for å generere domenekontrollere fra benmarg blitt mye brukt av forskere⁶. Selv om protokollen er effektiv for å skaffe DC-celler, er den kompleks og dyr, som involverer tilsetning av høye konsentrasjoner av cytokiner og lysis av røde blodlegemer.

I denne studien rapporterer vi en metode for å isolere nesten alle benmargsceller fra musbenmarg (BM) og indusere differensiering i BMDC etter 7-9 dager med inkubasjon in vitro, med en lavere konsentrasjon av GM-CSF og IL-4. Denne prosedyren tar bare 10 min å høste nesten alle benmargsceller og å suspendere dem i et komplett medium. Kort fortalt tilbyr vi en effektiv og kostnadseffektiv kultiveringsmetode for BMDC i denne forskningen.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent av Nanjing Medical University Animal Care and Use Committee. 1. Isolering av benmarg og tilberedning av BM-celler Ofre C57BL/6 mus (18-22 g, 6-8 uker gammel) via CO 2-kvelning. Fest musen på musens operasjonsbord. Desinfiser overflatene med 70% etanol. Klipp huden på beinet for å eksponere musklene og lårarterien. Klem og riv av lårarterien ved hjelp av to tang, og trekk deretter den proksimale enden mot magen.<b…

Representative Results

Cellene 1 x 10 7-1,7 x 107 ble ekstrahert fra to lårben og ble suspendert i 24 ml medium før de ble plantet i en 6-brønns plate (figur 1A). Etter 2 dager ble ikke-tilhengerceller fjernet ved å endre kulturmediet helt. Før du endret mediet, ble det observert et betydelig antall suspenderte celler (figur 1B). Etter 3 dager med kultur begynte småcellekolonier å danne seg. På den sjette dagen økte størrelsen og antall kolonier betydel…

Discussion

Mennesker og mus har forskjellige DC-delsett, inkludert klassiske domenekontrollere (CDCC-er, inkludert cDC1s og cDC2s) plasmacytoid-domenekontrollere (PDC-er) og monocytt-avledede domenekontrollere (MoDC)^9,10,11. Det er generelt akseptert at cDC1s regulerer cytotoksisk T-lymfocytt (CTL) respons på intracellulære patogener og kreft, og cDC2s regulerer immunresponsen på ekstracellulære patogener, parasitter og allergener<sup …

Materials

β-Mercaptoethanol	Solarbio	M8211
6-well plate	Corning	3516
APC-MHC II	Biolegend	116417
FBS	Gibco	10100
PE-CD80	Biolegend	104707
Penicillin-Streptomycin	Solarbio	P1400
Percp/cy5.5-CD11c	Biolegend	117327
PRMI-1640	Thermo	11875093
Recombinant Mouse GM-CSF	Solarbio	P00184
Recombinant Mouse IL-4	Solarbio	P00196
TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody	Biolegend	156603