JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

리포터 발현 재조합 SARS-CoV-2를 이용한 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서의 바이러스 감염의 라이브 이미징 및 정량화

Published: November 05, 2021
doi:
10.3791/63127
, , , , ,
1Texas Biomedical Research Institute

Summary

이 프로토콜은 생체 내에서 SARS-CoV-2 감염을 연구하는 데 필요한 2차 접근법의 필요성을 극복하기 위해 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서 루시페라아제 및 형광 발현 재조합 (r)SARS-CoV-2 및 생체내 이미징 시스템 (IVIS)을 사용하는 바이러스 감염의 역학을 기술한다.

Abstract

코로나 바이러스 질병 2019 (COVID-19) 전염병은 심각한 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2)에 의해 발생했습니다. 현재까지 SARS-CoV-2는 전 세계적으로 242 백만 명이 넘는 감염과 4.9 백만 명 이상의 사망자를 담당했습니다. 다른 바이러스와 마찬가지로 SARS-CoV-2를 연구하려면 감염된 세포 및 / 또는 동물 모델에서 바이러스의 존재를 탐지하기 위해 실험 방법을 사용해야합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 생체발광 (나노루시페라제, Nluc) 또는 형광 (금성) 단백질을 발현하는 복제 적격 재조합 (r) SARS-CoV-2를 생성하였다. 이러한 리포터-발현 rSARS-CoV-2는 Nluc 및 금성 리포터 유전자의 발현에 기초하여 시험관내 및 생체내에서 바이러스 감염을 추적할 수 있게 한다. 여기에서 연구는 앞서 기술한 K18 인간 안지오텐신-전환 효소 2(hACE2) 생체내 영상 시스템(IVIS)을 이용한 감염의 형질전환 마우스 모델에서 SARS-CoV-2 감염을 검출하고 추적하기 위해 rSARS-CoV-2/Nluc 및 rSARS-CoV-2/Venus의 사용을 기술 한다 . 이 rSARS-CoV-2/Nluc 및 rSARS-CoV-2/Venus는 생체 내에서 rSARS-CoV-2/WT와 같은 병원성 및 바이러스 복제를 보여줍니다. 중요하게도, Nluc 및 Venus 발현은 우리가 감염된 마우스에서 생체 내 및 생체외에서 바이러스 감염을 직접 추적할 수 있게 해준다. 이러한 rSARS-CoV-2/Nluc 및 rSARS-CoV-2/Venus는 생체 내에서 SARS-CoV-2의 생물학을 연구하고, 바이러스 감염 및 관련 COVID-19 질병을 이해하고, SARS-CoV-2 감염과 싸우기 위한 효과적인 예방 및/또는 치료 치료법을 식별하는 데 탁월한 옵션을 제공합니다.

Introduction

중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2)는 코로나 비리 대 (Coronaviridae) 계열1의 베타 코로나 바이러스 계통에 속하는 외피, 양성 감각, 단일 가닥 RNA 바이러스입니다. 이 바이러스 군은 알파-, 베타-, 감마-, 델타-코로나바이러스1로 나뉜다. 알파 및 베타 코로나 바이러스는 주로 포유류를 감염시키는 반면, 감마 및 델타 코로나 바이러스는 거의 독점적으로 조류를 감염시킵니다 2. 현재까지 일곱 개의 코로나바이러스(CoV)가 종 장벽을 넘어 인간 코로나바이러스(HCoV)로 등장했다: 두 개의 알파-CoV(HCoV-229E 및 HCoV-NL63)와 5개의 베타-CoV(HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, 중동호흡기 증후군 코로나바이러스[MERS-CoV], SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV 및 SARS-CoV-2는 병원성이 높아 심한 하부 호흡기 감염을 일으킵니다 7. SARS-CoV-2가 출현하기 전에 CoVs에 의해 야기 된 두 가지 전염병 발생이있었습니다 : 2002-2003 년 중국 광동 프로비던스의 SARS-CoV, 약 9.7 %의 치사율 (CFR); 2012 년부터 현재까지 중동의 MERS-CoV와 CFR은 약 34 % 7,8입니다. SARS-CoV-2는 3.4 % -49 % 사이의 전체 CFR을 가지며 기본 조건은 더 높은 CFR 8,9에 기여합니다. SARS-CoV-2는 2019년 12월 중국 우한에서 발견된 이래 전 세계적으로 242백만 명이 넘는 인간 감염과 4백9십만 명 이상의 인간 사망 7,10,11,12명을 담당하고 있습니다. 특히, 2020년 말부터 새로운 SARS-CoV-2 변종(VoC)과 관심 변종(VoI)은 전염 및 항원성 9,13, COVID-19 전염병의 전반적인 방향을 포함한 바이러스 특성에 영향을 미쳤습니다. SARS-CoV-2 감염의 치료를 위해 현재 미국 (미국)은 단 하나뿐입니다. 식품 의약품 안전청 (FDA) 치료 항 바이러스 (렘데시비르) 및 하나의 긴급 사용 허가 (EUA) 약물 (바리시티닙, 렘데시비르와 함께 투여되는)14. 또한 6개의 승인된 EUA 모노클로날 항체가 있다: REGEN-COV (카시리비맙 및 임데비맙, 함께 투여됨), 소트로비맙, 토실리주맙, 바멜라니비맙 및 에테세비맙이 함께 투여된15,16,17,18,19. 현재 FDA가 승인한 예방백신인 화이자-바이오엔테크는 단 하나뿐이며, 다른 두 가지 예방백신(모더나와 얀센)은 20,21,22,23,24유로 승인을 받았다. 그러나 통제되지 않은 감염률과 VoC 및 VoI의 출현으로 SARS-CoV-2는 여전히 인체 건강에 위협이되고 있습니다. 따라서 SARS-CoV-2 감염과 여전히 진행중인 COVID-19 전염병을 통제하기위한 효율적인 예방 및 치료제를 식별하기 위해 새로운 접근법이 시급히 필요합니다.

SARS-CoV-2를 연구하려면 감염된 세포 및 / 또는 검증 된 동물 감염 모델에서 바이러스의 존재를 확인하기위한 힘든 기술과 2 차 접근법이 필요합니다. 역 유전학의 사용은 바이러스 감염의 생물학에서 중요한 질문에 대답하는 재조합 바이러스의 생성을 허용했다. 예를 들어, 역유전학 기술은 바이러스 감염, 병인 및 질병의 메커니즘을 밝히고 이해하는 수단을 제공했습니다. 마찬가지로, 역유전학 접근법은 바이러스 단백질이 부족한 재조합 바이러스를 조작하여 바이러스 병인에 대한 기여도를 이해하는 길을 열었습니다. 또한, 역유전학 기술은 바이러스 감염의 치료를 위한 예방적 및/또는 치료적 접근법을 확인하는 것을 포함하여, 시험관내 및 생체내 응용을 위해 리포터 유전자를 발현하는 재조합 바이러스를 생성하는데 사용되어 왔다. 형광 및 생체발광 단백질은 그들의 민감도, 안정성 및 신기술25,26의 개선에 기초한 용이한 검출로 인해 가장 일반적으로 사용되는 리포터 유전자이다. 시험관 내에서 형광 단백질은 감염된 세포에서 바이러스의 국소화를위한 더 나은 옵션으로 작용하는 것으로 밝혀졌으며 루시페라제는 정량화 연구 27,28,29에 더 편리합니다. 생체 내에서, 루시페라제는 전체 동물 영상화를 위한 형광 단백질보다 선호되는 반면, 형광 단백질은 감염된 세포의 확인 또는 생체외 영상화(30,31,32)에 바람직하다. 리포터 발현 재조합 바이러스의 사용은 플라비바이러스, 엔테로바이러스, 알파바이러스, 렌티바이러스, 아레나바이러스 및 인플루엔자 바이러스28,33,34,35,36을 포함한 많은 패밀리에서 바이러스를 연구하기 위한 강력한 도구로 사용되었다.

SARS-CoV-2를 연구하고 생체 내에서 실시간 SARS-CoV-2 감염을 특성화하기위한 2 차 접근법의 필요성을 극복하기 위해 우리는 이전에 설명 된 박테리아 인공 염색체 (BAC) 기반 역 유전학을 사용하여 생체 발광 (nanoluciferase, Nluc) 또는 형광 (금성) 단백질을 발현하는 복제 적격 재조합 (r) SARS-CoV-2를 생성했습니다. 박테리아37,38에서 그의 전파 동안 바이러스 서열의 독성을 최소화하기 위해. 특히, rSARS-CoV-2/Nluc 및 rSARS-CoV-2/Venus는 생체 내에서 rSARS-CoV-2/WT와 유사한 병원성을 나타냈다. rSARS-CoV-2/Venus로부터의 높은 수준의 금성 발현은 생체내 영상화 시스템(IVIS)39를 사용하여 감염된 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스의 폐에서 바이러스 감염을 검출하는 것을 허용하였다. 금성 발현의 수준은 폐에서 검출된 바이러스 역가와 잘 상관관계가 있으며, 이는 SARS-CoV-2 감염의 유효한 대리자로 금성 발현을 사용하는 타당성을 입증하였다. rSARS-CoV-2/Nluc를 사용하여 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서 동일한 IVIS 접근법을 사용하여 실시간으로 바이러스 감염의 역학을 추적하고 종적으로 생체 내에서 SARS-CoV-2 감염을 종방향으로 평가할 수 있었습니다.

Protocol

K18 hACE2 트랜스제닉 마우스와 관련된 프로토콜은 Texas Biomedical Research Institute (TBRI) Institutional Biosafety Committee (IBC) 및 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았다. 모든 실험은 국가 연구위원회 (National Research Council)40의 실험실 동물 관리 및 사용 안내서의 권장 사항을 따릅니다. 마우스와 함께 작업 할 때 적절한 개인 보호 장비 (PPE)가 필요합니다. <str…

Representative Results

K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서의 rSARS-CoV-2/Nluc 감염 (도 1 및 2)도 1A는 생체내 감염을 평가하기 위해 사용된 rSARS-CoV-2/WT(상단) 및 rSARS-CoV-2/Nluc(하단)의 개략적인 표현을 보여준다. 도 1B는 K18 hACE2 트랜스제닉 마우스에서 rSARS-CoV-2/Nluc 감염 역학을 평가하기 위해 적용된 개략적인 흐름도를 보여준다….

Discussion

이 프로토콜은 생체 내에서 바이러스 감염을 모니터링하기 위해 이러한 rSARS-CoV-2 발현 리포터 유전자를 사용하는 타당성을 입증한다. 두 리포터 발현 재조합 바이러스는 생체 내에서 SARS-CoV-2 감염을 연구하기위한 훌륭한 도구를 제공합니다. 기술된 생체 외 (rSARS-CoV-2/금성) 및 생체내 (rSARS-CoV-2/Nluc) 이미징 시스템은 SARS-CoV-2 감염, 바이러스 병인의 역학을 이해하고 바이?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 COVID-19 전염병 기간 동안 시설을 완전히 운영하고 안전하게 유지하려는 노력에 대해 우리 연구소 (Texas Biomedical Research Institute)의 회원들에게 감사드립니다. 우리는 또한 우리의 프로토콜을 시간 효율적인 방식으로 검토해 주신 IBC(Institutional Biosafety Committee)와 주문(IACUC)에 감사드립니다. 우리는 SARS-CoV 교차 반응성 1C7C7 뉴클레오캡시드 (N) 단백질 모노클로날 항체를 제공해준 마운트 시나이 의과 대학의 토마스 모란 박사에게 감사드립니다. 마르티네즈-소브리도 실험실에서의 SARS-CoV-2 연구는 현재 NIAID/NIH 보조금 RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 및 R43AI165089-01에 의해 지원되고 있습니다. 국방부 (DoD)는 W81XWH2110095 및 W81XWH2110103을 부여합니다. 정밀 치료를위한 샌 안토니오 파트너십; 텍사스 생물 의학 연구소 포럼; 샌 안토니오에있는 텍사스 대학 건강 과학 센터; 샌안토니오 의료 재단; 인플루엔자 병인 및 전염 연구 센터 (CRIPT), NIAID가 자금을 지원하는 인플루엔자 연구 및 대응 우수 센터 (CEIRR, 계약 # 75N93021C00014)에 의해.

Materials

0.5% Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at room temperature (RT)
1% DEAE-Dextran MP Biomedicals 195133
10% Formalin solution, neutral buffered Sigma-Aldrich HT501128
Agar Oxoid LP0028
24-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 662160
5% Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S-5761
6-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 657160
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) ATCC CRL-1586
Ami HT Spectral Instruments Imaging
Aura Imaging Software 3.2.0 Spectral Instruments Imaging Image analysis software
Bovine Serum Albumin (BSA), 35% Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Anesthesia gas machine Veterinary Anesthesia Systems, Inc. VAS 2001R
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice The Jackson Laboratory 34860
Graphpad Prism Version 9.1.0 GraphPad
Isoflurane Baxter 1001936040 Store at RT
MARS Data Analysis Software BMG LABTECH
MB10 tablets QUIP Laboratories MBTAB1.5 Store at RT
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent Promega N1110 This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
PHERAstar FSX BMG LABTECH PHERAstar FSX
Precelleys Evolution homogenizer Bertin Instruments P000062-PEVO0-A
Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL Bertin Instruments P000940-LYSK0-A
T75 EasYFlask ThermoFisher Scientific 156499
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase Vector Laboratories PK-4002 ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. V’Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
  2. Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423 (2020).
  3. Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
  4. Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).
  5. Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
  6. Evans, J. P., Liu, S. L. Role of host factors in SARS-CoV-2 entry. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847 (2021).
  7. Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
  8. Alfaraj, S. H., et al. Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study. Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).
  9. Harvey, W. T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).
  10. Dong, E., Du, H., Gardner, L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).
  11. Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers. Elife. 9, 57309 (2020).
  12. Roussel, Y., et al. SARS-CoV-2: fear versus data. International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947 (2020).
  13. Scialo, F., et al. SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants. Biomedicines. 9 (6), 611 (2021).
  14. . Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19 Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19 (2021)
  15. Dougan, M., et al. Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19. New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).
  16. Ledford, H. COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease. Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).
  17. Tuccori, M., et al. An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future. Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).
  18. Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia. Cureus. 13 (5), 15280 (2021).
  19. O’Brien, M. P., et al. Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
  20. Beigel, J. H., et al. Remdesivir for the treatment of Covid-19 – Final report. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).
  21. Li, L., et al. Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).
  22. Polack, F. P., et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  23. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices’ interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine – United States, December 2020. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).
  24. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices’ interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine – United States, February 2021. Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).
  25. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
  26. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  27. Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections. Journal of Virology. 93 (10), 00032 (2019).
  28. Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2016).
  29. Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
  30. Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
  31. Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).
  32. Luker, G. D., et al. Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice. Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).
  33. Li, X., et al. Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus. Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).
  34. Kirui, J., Freed, E. O. Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release. Retrovirology. 17 (1), 12 (2020).
  35. Shang, B., et al. Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening. Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).
  36. Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).
  37. Ye, C., et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome. mBio. 11 (5), 02168 (2020).
  38. Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537 (2019).
  39. Chiem, K., et al. A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo. Journal of Virology. , (2021).
  40. Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn. National Research Council (US). , (2011).
  41. Ye, C., et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).

Tags

Keywords: Live ImagingQuantificationViral InfectionK18 HACE2 Transgenic MiceReporter-expressing Recombinant SARS-CoV-2In VivoEx VivoFluorescenceBioluminescenceLuciferaseIVISLungsNecropsy
check_url/fr/63127?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Morales Vasquez, D., Chiem, K., Silvas, J., Park, J., Ye, C., Martínez-Sobrido, L. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (177), e63127, doi:10.3791/63127 (2021).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image