Дрозофила меланогастер Протокол инжекции личинок
Summary
Взрослые мухи Drosophila melanogaster широко использовались в качестве модельных организмов для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе врожденных иммунных реакций хозяина противомикробных препаратов и стратегий микробной инфекции. Для продвижения стадии личинки D. melanogaster в качестве дополнительной или альтернативной модельной системы описана методика личиночного впрыска.
Abstract
Использование нетрадиционных моделей для изучения врожденного иммунитета и вирулентности патогенов обеспечивает ценную альтернативу моделям млекопитающих, которые могут быть дорогостоящими и поднимать этические вопросы. Нетрадиционные модели, как известно, дешевы, просты в обращении и культуре, и не занимают много места. Они генетически поддаются и обладают полными последовательностями генома, и их использование не представляет никаких этических соображений. Плодовая муха Drosophila melanogaster, например, дала отличное представление о различных исследованиях поведения, развития, метаболизма и иммунитета. Более конкретно, взрослые мухи и личинки D. melanogaster обладают несколькими врожденными защитными реакциями, которые разделяются с позвоночными животными. Механизмы, регулирующие иммунные реакции, были в основном выявлены с помощью генетических и молекулярных исследований в модели D. melanogaster . Здесь представлен новый метод инъекции личинок, который будет способствовать дальнейшим исследованиям врожденных иммунных процессов у личинок D. melanogaster и изучению патогенеза широкого спектра микробных инфекций.
Introduction
Drosophila melanogaster широко используется в биологических и биомедицинских исследованиях в течение нескольких десятилетий, поскольку сложный набор генетических и молекулярных инструментов неуклонно развивался для анализа широкого спектра исследований1,2,3,4. Эволюционно сохраненные аспекты развития, гомеостаза и врожденного иммунитета у D. melanogaster сделали его ценным модельным организмом для изучения различных заболеваний человека и насекомых5,6. Примечательно, что фундаментальная роль модели D. melanogaster для изучения иммунитета была в значительной степени проиллюстрирована в исследованиях взрослых мух. Тем не менее, исследования личинок D. melanogaster также внесли свой вклад в современные знания и в основном изучили клеточные иммунные реакции, особенно на инфекции ос и нематод, которые происходят через кутикулу насекомых7,8,9,10. Личинки Drosophila melanogaster обладают тремя различными типами клеток крови, которые в совокупности называются гемоцитами: плазматоциты, кристаллические клетки и ламелоциты11,12,13. Эти клетки могут устанавливать множество иммунных реакций, когда личинки D. melanogaster заражены патогенами, такими как бактерии, грибки, вирусы и паразиты14,15,16. Клеточные иммунные реакции включают прямое поглощение (фагоцитоз) малых молекул или бактерий, меланизацию, инкапсуляцию более крупных патогенов, таких как паразитоидные яйца, и производство активных форм кислорода (АФК) и синтаз оксида азота (NOS)17,18,19.
Напротив, было опубликовано меньше исследований по использованию модели личинок D. melanogaster для анализа гуморальных иммунных реакций. Это в основном связано с применением кормовых анализов на оральную инфекцию личинок D. melanogaster и несколькими проблемами, связанными с микроинъекцией личинок, включая точное обращение с личинками и правильное использование микроиглы, особенно во время проникновения20,21. Таким образом, ограниченные знания о личиночной инфекции и технические трудности (т.е. высокая смертность) часто затрудняли использование модели личинок D. melanogaster. Личиночная модель будет иметь потенциал для выявления новых молекулярных механизмов, которые обеспечат дальнейшее понимание взаимодействий хозяина и патогена и индукции специфических врожденных иммунных реакций хозяина против патогенных инфекций.
Здесь подробно описан простой и эффективный протокол, который можно использовать для введения личинкам D. melanogaster различных патогенов, таких как бактерии. В частности, личинки D. melanogaster используются для инъекций с человеческим возбудителем Photorhabdus asymbiotica и непатогенными бактериями Escherichia coli. Этот метод может быть использован для манипуляций и анализа иммунных реакций D. melanogaster на различные микробные инфекции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila melanogaster является одной из наиболее ценных, экспериментально манипулируемых моделей, используемых для исследований врожденного иммунитета и патогенеза различных микробных инфекций. Это связано с его простым и быстрым жизненным циклом, простым обслуживанием в лаборатории, х?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим сотрудников Департамента биологических наук Университета Джорджа Вашингтона (GWU) за критическое прочтение рукописи. GT была поддержана через летнюю стипендию Harlan от GWU. Все графические рисунки были сделаны с помощью BioRender.
Materials
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes – plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (21), 13705-13710 (2002).
- Senger, K., Harris, K., Levine, M. GATA factors participate in tissue-specific immune responses in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (43), 15957-15962 (2006).
- Kenmoku, H., Hori, A., Kuraishi, T., Kurata, S. A novel mode of induction of the humoral innate immune response in Drosophila larvae. Disease Models & Mech.anisms. 10, 271-281 (2017).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D., Eleftherianos, I. Heterorhabditis bacteriophora excreted-secreted products enable infection by Photorhabdus luminescens through suppression of the Imd pathway. Frontiers in Immunology. 10, 2372 (2019).
- Cherry, S., Silverman, N. Host-pathogen interactions in Drosophila: New tricks from an old friend. Nature Immunology. 7 (9), 911-917 (2006).
- Younes, S., Al-Sulaiti, A., Nasser, E., Najjar, H., Kamareddine, L. Drosophila as a model organism in host-pathogen interaction studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 214 (2020).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal for Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Leitão, A. B., Bian, X., Day, J. P., Pitton, S., Demir, E., Jiggins, F. M. Independent effects on cellular and humoral immune responses underlie genotype-by-genotype interactions between Drosophila and parasitoids. PLoS Pathogens. 15 (10), 1008084 (2019).
- Ramroop, J. R., Heavner, M. E., Razzak, Z. H., Govind, S. A. Parasitoid wasp of Drosophila employs preemptive and reactive strategies to deplete its host’s blood cells. PLoS Pathogens. 17 (5), 1009615 (2021).
- Vlisidou, I., Wood, W. Drosophila blood cells and their role in immune responses. The FEBS Journal. 282 (8), 1368-1382 (2015).
- Harnish, J. M., Link, N., Yamamoto, S. Drosophila as a model for infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2724 (2017).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Reviews of Immunology. 25, 697-743 (2007).
- Garriga, A., Mastore, M., Morton, A., Pino, F. G., Brivio, M. F. Immune response of Drosophila suzukii larvae to infection with the nematobacterial complex Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila. Insects. 11 (4), 210 (2020).
- Trienens, M., Kraaijeveld, K., Wertheim, B. Defensive repertoire of Drosophila larvae in response to toxic fungi. Molecular Ecology. 26 (19), 5043-5057 (2017).
- Tafesh-Edwards, G., Eleftherianos, I. Drosophila immunity against natural and nonnatural viral pathogens. Virology. 540, 165-171 (2020).
- Gold, K. S., Brückner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Seminars in Immunology. 27 (6), 357-368 (2015).
- Dudzic, J. P., Kondo, S., Ueda, R., Bergman, C. M., Lemaitre, B. Drosophila innate immunity: regional and functional specialization of prophenoloxidases. BMC Biology. 13, 81 (2015).
- Honti, V., Csordás, G., Kurucz, &. #. 2. 0. 1. ;., Márkus, R., Andó, I. The cell-mediated immunity of Drosophilamelanogaster: hemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation. Developmental and Comparative Immunology. 42 (1), 47-56 (2014).
- Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral bacterial infection and shedding in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57676 (2021).
- Zabihihesari, A., Hilliker, A. J., Rezai, P. Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate. Lab on a Chip. 20 (2), 343-355 (2020).
- Flatt, T. Life-history evolution and the genetics of fitness components in Drosophila melanogaster. Génétique. 214 (1), 3-48 (2020).
- Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: a nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Developmental Biology. 7, 101 (2007).
- Joyce, S. A., Watson, R. J., Clarke, D. J. The regulation of pathogenicity and mutualism in Photorhabdus. Current Opinion in Microbiology. 9 (2), 127-132 (2006).
- Yang, G., Waterfield, N. R. The role of TcdB and TccC subunits in secretion of the Photorhabdus Tcd toxin complex. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003644 (2013).
- Shokal, U., et al. Effects of co-occurring Wolbachia and Spiroplasma endosymbionts on the Drosophila immune response against insect pathogenic and non-pathogenic bacteria. BMC Microbiology. 16, 16 (2016).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214 (11), 575-578 (2004).
