Drosophila melanogaster Larve injeksjon protokoll
Summary
Drosophila melanogaster voksne fluer har blitt mye brukt som modellorganismer for å undersøke de molekylære mekanismene som ligger til grunn for antimikrobielle medfødte immunresponser og mikrobielle infeksjonsstrategier. For å fremme D. melanogaster larvestadiet som et ekstra eller alternativt modellsystem, beskrives en larval injeksjonsteknikk.
Abstract
Bruk av ukonvensjonelle modeller for å studere medfødt immunitet og patogen virulens gir et verdifullt alternativ til pattedyrmodeller, som kan være kostbare og reise etiske spørsmål. Ukonvensjonelle modeller er notorisk billige, enkle å håndtere og kultur, og tar ikke mye plass. De er genetisk mottagelige og har komplette genomsekvenser, og deres bruk gir ingen etiske hensyn. Fruktfluen Drosophila melanogaster har for eksempel gitt stor innsikt i en rekke atferds-, utviklings-, metabolisme- og immunitetsforskning. Mer spesifikt har D. melanogaster voksne fluer og larver flere medfødte forsvarsreaksjoner som deles med virveldyrdyr. Mekanismene som regulerer immunresponser har for det meste blitt avslørt gjennom genetiske og molekylære studier i D. melanogaster-modellen . Her er det gitt en ny larvalinjeksjonsteknikk, som ytterligere vil fremme undersøkelser av medfødte immunprosesser i D. melanogaster larver og utforske patogenesen av et bredt spekter av mikrobielle infeksjoner.
Introduction
Drosophila melanogaster har blitt enormt brukt i biologisk og biomedisinsk forskning i flere tiår, da det sofistikerte utvalget av genetiske og molekylære verktøy har utviklet seg jevnt for analyse av et bredt spekter av studier1,2,3,4. De evolusjonært bevarte aspektene ved utvikling, homeostase og medfødt immunitet i D. melanogaster har gjort det til en verdifull modellorganisme for å studere ulike menneskelige og insektssykdommer5,6. Spesielt har D. melanogaster-modellens grunnleggende rolle for å studere immunitet i stor grad blitt eksemplifisert i voksne fluestudier. Imidlertid har D. melanogaster larver studier også bidratt til dagens kunnskap og hovedsakelig utforsket cellulære immunresponser, spesielt for veps og nematode infeksjoner som oppstår gjennom insektet cuticle7,8,9,10. Drosophila melanogaster larver har tre forskjellige typer blodceller, samlet kalt hemocytter: plasmatocytter, krystallceller og lamellocytter11,12,13. Disse cellene kan montere en rekke immunresponser når D. melanogaster larver er smittet med patogener som bakterier, sopp, virus og parasitter14,15,16. Cellulære immunresponser inkluderer direkte engulfment (fagocytose) av små molekyler eller bakterier, melanisering, innkapsling av større patogener som parasitoide egg og produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) og nitrogenoksidsynthaser (NOS) 17,18,19.
I motsetning til dette er det publisert færre studier om bruk av D. melanogaster larval-modellen for å analysere humorale immunresponser. Dette skyldes hovedsakelig anvendelsen av fôringsanalyser for oral infeksjon av D. melanogaster larver og flere utfordringer forbundet med mikroinjektiv larver, inkludert presis håndtering av larver og riktig bruk av mikroneedlen, spesielt under penetrasjon20,21. Dermed har den begrensede kunnskapen om larvinfeksjon og tekniske vanskeligheter (dvs. høy dødelighet) ofte gjort D. melanogaster larvalmodellen vanskelig å bruke. En larvalmodell vil ha potensial til å identifisere nye molekylære mekanismer som vil gi ytterligere innsikt i vertspatogeninteraksjoner og induksjon av spesifikke verts medfødte immunresponser mot patogene infeksjoner.
Her er en enkel og effektiv protokoll som kan brukes til å injisere D. melanogaster larver med ulike patogener, som bakterier, beskrevet i detalj. Spesielt brukes D. melanogaster larver til injeksjoner med det menneskelige patogenet Photorhabdus asymbiotica og de ikke-patogene bakteriene Escherichia coli. Denne metoden kan brukes til manipulering og analyse av D. melanogasters immunresponser på ulike mikrobielle infeksjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila melanogaster er blant de mest verdifulle, eksperimentelt manipulerte modellene som brukes til undersøkelser av medfødt immunitet og patogenese av ulike mikrobielle infeksjoner. Dette skyldes sin enkle og raske livssyklus, enkel vedlikehold i et laboratorium, veletablert evolusjonær genetikk og mangfoldig genetisk verktøykasse. Tidligere metoder for D. melanogaster larver injeksjoner, for eksempel bruk av en hybrid mikrofluidisk enhet eller en Narishige mikromanipulator, krever høyt spesi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer av Institutt for biovitenskap ved George Washington University (GWU) for kritisk lesning av manuskriptet. GT ble støttet gjennom et Harlan sommerstipend fra GWU. Alle grafiske figurer ble laget ved hjelp av BioRender.
Materials
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes – plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (21), 13705-13710 (2002).
- Senger, K., Harris, K., Levine, M. GATA factors participate in tissue-specific immune responses in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (43), 15957-15962 (2006).
- Kenmoku, H., Hori, A., Kuraishi, T., Kurata, S. A novel mode of induction of the humoral innate immune response in Drosophila larvae. Disease Models & Mech.anisms. 10, 271-281 (2017).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D., Eleftherianos, I. Heterorhabditis bacteriophora excreted-secreted products enable infection by Photorhabdus luminescens through suppression of the Imd pathway. Frontiers in Immunology. 10, 2372 (2019).
- Cherry, S., Silverman, N. Host-pathogen interactions in Drosophila: New tricks from an old friend. Nature Immunology. 7 (9), 911-917 (2006).
- Younes, S., Al-Sulaiti, A., Nasser, E., Najjar, H., Kamareddine, L. Drosophila as a model organism in host-pathogen interaction studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 214 (2020).
- Kenney, E., Hawdon, J. M., O’Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal for Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
- Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
- Leitão, A. B., Bian, X., Day, J. P., Pitton, S., Demir, E., Jiggins, F. M. Independent effects on cellular and humoral immune responses underlie genotype-by-genotype interactions between Drosophila and parasitoids. PLoS Pathogens. 15 (10), 1008084 (2019).
- Ramroop, J. R., Heavner, M. E., Razzak, Z. H., Govind, S. A. Parasitoid wasp of Drosophila employs preemptive and reactive strategies to deplete its host’s blood cells. PLoS Pathogens. 17 (5), 1009615 (2021).
- Vlisidou, I., Wood, W. Drosophila blood cells and their role in immune responses. The FEBS Journal. 282 (8), 1368-1382 (2015).
- Harnish, J. M., Link, N., Yamamoto, S. Drosophila as a model for infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2724 (2017).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Reviews of Immunology. 25, 697-743 (2007).
- Garriga, A., Mastore, M., Morton, A., Pino, F. G., Brivio, M. F. Immune response of Drosophila suzukii larvae to infection with the nematobacterial complex Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila. Insects. 11 (4), 210 (2020).
- Trienens, M., Kraaijeveld, K., Wertheim, B. Defensive repertoire of Drosophila larvae in response to toxic fungi. Molecular Ecology. 26 (19), 5043-5057 (2017).
- Tafesh-Edwards, G., Eleftherianos, I. Drosophila immunity against natural and nonnatural viral pathogens. Virology. 540, 165-171 (2020).
- Gold, K. S., Brückner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Seminars in Immunology. 27 (6), 357-368 (2015).
- Dudzic, J. P., Kondo, S., Ueda, R., Bergman, C. M., Lemaitre, B. Drosophila innate immunity: regional and functional specialization of prophenoloxidases. BMC Biology. 13, 81 (2015).
- Honti, V., Csordás, G., Kurucz, &. #. 2. 0. 1. ;., Márkus, R., Andó, I. The cell-mediated immunity of Drosophilamelanogaster: hemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation. Developmental and Comparative Immunology. 42 (1), 47-56 (2014).
- Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral bacterial infection and shedding in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57676 (2021).
- Zabihihesari, A., Hilliker, A. J., Rezai, P. Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate. Lab on a Chip. 20 (2), 343-355 (2020).
- Flatt, T. Life-history evolution and the genetics of fitness components in Drosophila melanogaster. Génétique. 214 (1), 3-48 (2020).
- Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: a nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Developmental Biology. 7, 101 (2007).
- Joyce, S. A., Watson, R. J., Clarke, D. J. The regulation of pathogenicity and mutualism in Photorhabdus. Current Opinion in Microbiology. 9 (2), 127-132 (2006).
- Yang, G., Waterfield, N. R. The role of TcdB and TccC subunits in secretion of the Photorhabdus Tcd toxin complex. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003644 (2013).
- Shokal, U., et al. Effects of co-occurring Wolbachia and Spiroplasma endosymbionts on the Drosophila immune response against insect pathogenic and non-pathogenic bacteria. BMC Microbiology. 16, 16 (2016).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214 (11), 575-578 (2004).
