Drosophila melanogaster Protocolo de inyección de larvas
Summary
Las moscas adultas de Drosophila melanogaster se han utilizado ampliamente como organismos modelo para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a las respuestas inmunes innatas antimicrobianas del huésped y las estrategias de infección microbiana. Para promover la etapa de larva de D. melanogaster como un sistema modelo adicional o alternativo, se describe una técnica de inyección larvaria.
Abstract
El uso de modelos no convencionales para estudiar la inmunidad innata y la virulencia de los patógenos proporciona una alternativa valiosa a los modelos de mamíferos, que puede ser costosa y plantear problemas éticos. Los modelos no convencionales son notoriamente baratos, fáciles de manejar y cultivar, y no ocupan mucho espacio. Son genéticamente susceptibles y poseen secuencias completas del genoma, y su uso no presenta consideraciones éticas. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster, por ejemplo, ha proporcionado grandes conocimientos sobre una variedad de investigaciones sobre el comportamiento, el desarrollo, el metabolismo y la inmunidad. Más específicamente, las moscas y larvas adultas de D. melanogaster poseen varias reacciones de defensa innatas que se comparten con los animales vertebrados. Los mecanismos que regulan las respuestas inmunes se han revelado principalmente a través de estudios genéticos y moleculares en el modelo de D. melanogaster . Aquí se proporciona una nueva técnica de inyección larvaria, que promoverá aún más las investigaciones de los procesos inmunes innatos en larvas de D. melanogaster y explorará la patogénesis de una amplia gama de infecciones microbianas.
Introduction
Drosophila melanogaster ha sido inmensamente utilizado en la investigación biológica y biomédica durante varias décadas, ya que la sofisticada gama de herramientas genéticas y moleculares han evolucionado constantemente para el análisis de una amplia gama de estudios1,2,3,4. Los aspectos evolutivamente conservados del desarrollo, la homeostasis y la inmunidad innata en D. melanogaster lo han convertido en un valioso organismo modelo para el estudio de diversas enfermedades humanas e insectos5,6. En particular, el papel fundamental del modelo de D. melanogaster para estudiar la inmunidad se ha ejemplificado en gran medida en estudios de moscas adultas. Sin embargo, los estudios de larvas de D. melanogaster también han contribuido al conocimiento actual y han explorado principalmente las respuestas inmunes celulares, específicamente para las infecciones por avispas y nematodos que ocurren a través de la cutícula de insectos7,8,9,10. Las larvas de Drosophila melanogaster poseen tres tipos diferentes de células sanguíneas, llamadas colectivamente hemocitos: plasmatocitos, células cristalinas y lamelocitos11,12,13. Estas células pueden montar una serie de respuestas inmunes cuando las larvas de D. melanogaster están infectadas con patógenos como bacterias, hongos, virus y parásitos14,15,16. Las respuestas inmunes celulares incluyen envolvimiento directo (fagocitosis) de moléculas pequeñas o bacterias, melanización, encapsulación de patógenos más grandes como los huevos parasitoides y producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y sintasas de óxido nítrico (NOS)17,18,19.
En contraste, se han publicado menos estudios sobre el uso del modelo larvario de D. melanogaster para analizar las respuestas inmunes humorales. Esto se debe principalmente a la aplicación de ensayos de alimentación para la infección oral de larvas de D. melanogaster y a varios desafíos asociados con las larvas de microinyección, incluido el manejo preciso de las larvas y el uso adecuado de la microaguja, especialmente durante la penetración20,21. Por lo tanto, el conocimiento limitado de la infección larvaria y las dificultades técnicas (es decir, la alta mortalidad) han hecho que el modelo larvario de D. melanogaster sea difícil de usar. Un modelo larvario tendrá el potencial de identificar nuevos mecanismos moleculares que proporcionarán más información sobre las interacciones huésped-patógeno y la inducción de respuestas inmunes innatas específicas del huésped contra infecciones patógenas.
Aquí se describe en detalle un protocolo simple y eficiente que se puede usar para inyectar larvas de D. melanogaster con varios patógenos, como bacterias. En particular, las larvas de D. melanogaster se utilizan para inyecciones con el patógeno humano Photorhabdus asymbiotica y la bacteria no patógena Escherichia coli. Este método se puede utilizar para la manipulación y el análisis de las respuestas inmunes de D. melanogaster a diversas infecciones microbianas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila melanogaster es uno de los modelos manipulados experimentalmente más valiosos utilizados para las investigaciones de la inmunidad innata y la patogénesis de diversas infecciones microbianas. Esto se debe a su ciclo de vida simple y rápido, mantenimiento simple en un laboratorio, genética evolutiva bien establecida y diversa caja de herramientas genéticas. Los métodos anteriores de inyecciones de larvas de D. melanogaster, como el uso de un dispositivo microfluídico híbrido o un microm…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad George Washington (GWU) por la lectura crítica del manuscrito. GT fue apoyado a través de una beca de verano Harlan de GWU. Todas las figuras gráficas se hicieron utilizando BioRender.
Materials
| Fly Food B (Bloomington Recipe) | LabExpress | 7001-NV | Food B, in narrow vials, 100 vials/tray |
| 100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable | VWR | 25384-342 | Diameter 100 x 15 mm |
| 60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable | VWR | 25384-092 | Diameter 60 x 15 mm |
| Glass capillaries | VWR | 53440-186 | |
| Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle | VWR | 28450-150 | Diameter 150 mm |
| Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet | ESCO | LA2-4A2-E | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar miller powder 500 g |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | LB broth miller powder 500 g |
| Mineral oil | Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific | 31911-A1 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| Narrow Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee Scientific | 32-109 | |
| Needles, hypodermic | VWR | 89219-316 | 22 G, 25 mm |
| Next Generation Micropipette Puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | |
| PBS | VWR | 97062-732 | Buffer PBS tablets biotech grade 200tab |
| Prism | GraphPad | Version 8 | |
| Syringes – plastic, disposable | VWR | 76124-652 | 20 mL |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 |
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