Summary
यहां हम एक मानकीकृत एसएएच माउस मॉडल प्रस्तुत करते हैं, जो एंडोवैस्कुलर फिलामेंट वेध द्वारा प्रेरित होता है, जो सही रक्तस्राव साइट को सुनिश्चित करने और अन्य प्रासंगिक इंट्राक्रैनियल विकृति को बाहर करने के लिए ऑपरेशन के बाद चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) 24 घंटे के साथ संयुक्त होता है।
Abstract
सबराक्नोइड हेमरेज (एसएएच) की नकल करने के लिए एंडोवैस्कुलर फिलामेंट वेध मॉडल एक आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल है - हालांकि, तकनीक एक उच्च मृत्यु दर के साथ-साथ एसएएच और स्ट्रोक या इंट्राक्रैनियल रक्तस्राव जैसी अन्य इंट्राक्रैनियल जटिलताओं की बेकाबू मात्रा का कारण बन सकती है। इस प्रोटोकॉल में, एक मानकीकृत एसएएच माउस मॉडल प्रस्तुत किया जाता है, जो एंडोवैस्कुलर फिलामेंट वेध द्वारा प्रेरित होता है, जो सही रक्तस्राव साइट को सुनिश्चित करने और अन्य प्रासंगिक इंट्राक्रैनियल विकृति को बाहर करने के लिए ऑपरेशन के बाद चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के साथ 24 घंटे के साथ संयुक्त होता है। संक्षेप में, C57BL / 6J चूहों को एक इंट्रापेरिटोनियल केटामाइन / xylazine (70 मिलीग्राम / 16 मिलीग्राम / किग्रा शरीर का वजन) इंजेक्शन के साथ एनेस्थेटिक किया जाता है और एक सुपाइन स्थिति में रखा जाता है। मध्यरेखा गर्दन चीरा के बाद, आम कैरोटिड धमनी (सीसीए) और कैरोटिड विभाजन उजागर होते हैं, और एक 5-0 गैर-अवशोषक मोनोफिलामेंट पॉलीप्रोपाइलीन सीवन को बाहरी कैरोटिड धमनी (ईसीए) में प्रतिगामी फैशन में डाला जाता है और आम कैरोटिड धमनी में उन्नत किया जाता है। फिर, फिलामेंट को आंतरिक कैरोटिड धमनी (आईसीए) में संक्रमित किया जाता है और पूर्वकाल सेरेब्रल धमनी (एसीए) को छिद्रित करने के लिए आगे बढ़ाया जाता है। सर्जरी से उबरने के बाद, चूहों को 24 घंटे बाद 7.0 टी एमआरआई से गुजरना पड़ता है। रक्तस्राव की मात्रा को पोस्टऑपरेटिव एमआरआई के माध्यम से परिमाणित और वर्गीकृत किया जा सकता है, जिससे रक्त की मात्रा के आधार पर आगे उपसमूह विश्लेषण करने के विकल्प के साथ एक मजबूत प्रयोगात्मक एसएएच समूह सक्षम हो सकता है।
Introduction
Subarachnoid रक्तस्राव (एसएएच) एक इंट्राक्रैनियल एन्यूरिज्म के टूटने के कारण होता है और एक जीवन-धमकी वाली आपातकालीन स्थिति पैदा करता है, जो पर्याप्त रुग्णता और मृत्यु दर से जुड़ा होता है, जो लगभग 5% स्ट्रोक 1,2 के लिए लेखांकन करता है। एसएएच रोगियों गंभीर सिरदर्द, न्यूरोलॉजिकल शिथिलता, और चेतना की प्रगतिशील गड़बड़ी के साथ मौजूद3. एसएएच रोगियों के लगभग 30% प्रारंभिक रक्तस्राव की घटना 4 के बाद पहले 30 दिनों के भीतर मर जातेहैं। चिकित्सकीय रूप से, 50% रोगियों को प्रारंभिक मस्तिष्क की चोट के बाद मस्तिष्क की चोट (डीबीआई) में देरी का अनुभव होता है। डीबीआई विलंबित सेरेब्रल ischemia और विलंबित न्यूरोलॉजिकल घाटे की विशेषता है। वर्तमान अध्ययनों से पता चला है कि कई अलग-अलग कारकों के सहक्रियात्मक प्रभाव न्यूरोलॉजिकल फ़ंक्शन के नुकसान का कारण बनते हैं, जिसमें रक्त-मस्तिष्क बाधा का विनाश, छोटी धमनियों का संकुचन, माइक्रोसर्कुलेटरी डिसफंक्शन और थ्रोम्बोसिस 5,6 शामिल हैं।
एसएएच का एक अनूठा पहलू यह है कि रोगजनन एक एक्स्ट्रापैरेन्काइमल स्थान से उत्पन्न होता है, लेकिन फिर पैरेन्काइमा के अंदर हानिकारक कैस्केड की ओर जाता है: पैथोलॉजी सबराक्नोइड स्पेस में रक्त के संचय के साथ शुरू होती है, जो इंट्रापेरेन्काइमल प्रभावों की एक भीड़ को ट्रिगर करती है, जैसे कि न्यूरोइंफ्लेमेशन, न्यूरोनल और एंडोथेलियल सेल एपोप्टोसिस, कॉर्टिकल प्रसार विध्रुवीकरण, और मस्तिष्क एडिमा गठन7, ८ ।
नैदानिक अनुसंधान कई कारकों द्वारा सीमित है, जिससे पशु मॉडल लगातार और सटीक रूप से बीमारी के पैथोमैकेनिस्टिक परिवर्तनों की नकल करने में एक महत्वपूर्ण तत्व बन जाता है। विभिन्न एसएएच मॉडल प्रोटोकॉल प्रस्तावित किए गए हैं, उदाहरण के लिए, टंकी मैग्ना (एसीएम) में ऑटोलॉगस रक्त इंजेक्शन। इसके अलावा, टंकी मैग्ना और ऑप्टिक चियास्म टंकी (एपीसी) में ऑटोलॉगस रक्त के दोहरे इंजेक्शन के साथ एक संशोधित विधि क्रमशः 9,10। जबकि ऑटोलॉगस रक्त इंजेक्शन एक सरल तरीका है vasospasm और सूजन प्रतिक्रियाओं के रोग प्रक्रिया का अनुकरण करने के लिए subarachnoid रक्तस्राव के बाद, intracranial दबाव (आईसीपी) की निम्नलिखित वृद्धि अपेक्षाकृत धीमी है, और रक्त-मस्तिष्क बाधा की पारगम्यता में कोई उल्लेखनीय परिवर्तन11,12 प्रेरित कर रहे हैं। एक अन्य विधि, पेरिआर्टेरियल रक्त प्लेसमेंट, आमतौर पर बड़े एसएएच मॉडल (जैसे, बंदरों और कुत्तों) में उपयोग किया जाता है, जिसमें पोत के चारों ओर एंटीकोएगुलेटेड ऑटोलॉगस रक्त या तुलनीय रक्त उत्पादों को रखना शामिल है। धमनी के व्यास परिवर्तन को माइक्रोस्कोप के साथ देखा जा सकता है, जो एसएएच13 के बाद सेरेब्रल वैसोस्पास्म के लिए एक संकेतक के रूप में कार्य करता है।
बैरी एट अल ने पहली बार 1979 में एक एंडोवैस्कुलर वेध मॉडल का वर्णन किया था जिसमें खोपड़ी को हटाने के बाद बेसिलर धमनी उजागर होती है; धमनी को तब टंगस्टन माइक्रोइलेक्ट्रोड्स के साथ पंचर किया जाता है, एक माइक्रोस्कोपिक स्टीरियोटैक्टिक तकनीक14 का उपयोग करके। 1995 में, बेडरसन और वीलकेन ने सेरेब्रल इस्किमिया के ज़ीया-लांगा मॉडल को संशोधित किया और एंडोवैस्कुलर वेध की स्थापना की, जिसे15,16 के बाद से लगातार सुधार किया गया है। यह विधि इस तथ्य पर आधारित है कि चूहे और मनुष्य एक समान इंट्राक्रैनियल संवहनी नेटवर्क साझा करते हैं, जिसे विलिस के सर्कल के रूप में जाना जाता है।
माउस मॉडल में एसएएच के पश्चात मूल्यांकन और ग्रेडिंग के लिए, विभिन्न दृष्टिकोण प्रस्तावित किए गए हैं। सुगावरा एट अल ने एक ग्रेडिंग स्केल विकसित किया जिसका व्यापक रूप से उपयोग किया गया है 200817। यह विधि रूपात्मक परिवर्तनों के आधार पर एसएएच की गंभीरता का आकलन करती है। हालांकि, इस विधि के लिए, माउस के मस्तिष्क के ऊतक आकृति विज्ञान की प्रत्यक्ष दृष्टि के तहत जांच की जानी चाहिए, और इसलिए, माउस को मूल्यांकन के लिए बलिदान किया जाना चाहिए। इसके अलावा, विवो में एसएएच गंभीरता का निर्धारण करने के लिए कई तरीके स्थापित किए गए हैं। दृष्टिकोण सरल न्यूरोलॉजिकल स्कोरिंग से लेकर इंट्राक्रैनियल दबाव (आईसीपी) की निगरानी तक विभिन्न रेडियोलॉजिकल इमेजिंग तकनीकों तक होते हैं। इसके अलावा, एमआरआई ग्रेडिंग को एसएएच गंभीरता को ग्रेड करने के लिए एक नए, गैर-इनवेसिव टूल के रूप में दिखाया गया है, जो न्यूरोलॉजिकल स्कोर18,19 से संबंधित है।
यहां, एंडोवैस्कुलर वेध के कारण एसएएच मॉडल के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है, जो पोस्टऑपरेटिव एमआरआई के साथ संयुक्त होता है। विवो सेटिंग में रक्तस्राव की मात्रा को ऑब्जेक्टिफाई करने के लिए एक प्रणाली स्थापित करने के प्रयास में , हमने 7.0 टी उच्च-रिज़ॉल्यूशन टी 2-भारित एमआरआई के आधार पर कुल रक्त की मात्रा के एसएएच ग्रेडिंग और परिमाणीकरण के लिए एक प्रणाली भी विकसित की। यह दृष्टिकोण एसएएच के सही प्रेरण और स्ट्रोक, हाइड्रोसेफलस, या इंट्रासेरेब्रल हेमरेज (आईसीएच) और जटिलताओं जैसे अन्य विकृतियों के बहिष्करण को सुनिश्चित करता है।
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Protocol
प्रयोगों को Landesamt fuer Gesundheit und Soziales (LaGeSo), बर्लिन, जर्मनी (G0063/18) द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों और नियमों के अनुसार किया गया था। इस अध्ययन में, C57Bl / 6J पुरुष (8-12 सप्ताह पुराने) चूहों का उपयोग 25 ± 0.286 ग्राम (औसत ± s.e.m.) के वजन के साथ किया गया था।
1. पशु तैयारी
- केटामाइन (70 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (16 मिलीग्राम / किग्रा) इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट करके संज्ञाहरण को प्रेरित करें। सामान्य शरीर के तापमान को बनाए रखें, गहरी संज्ञाहरण के त्वरित प्रेरण में योगदान करते हैं। एक दर्द उत्तेजना के साथ पर्याप्त बेहोश करने की क्रिया के लिए परीक्षण करें, जैसे कि पैर की अंगुली की चुटकी, और प्रतिक्रिया की अनुपस्थिति को सत्यापित करें।
- सावधानी से एक रेजर के साथ माउस की गर्दन के बालों को शेव करें, इसे 70% इथेनॉल के साथ साफ करें, इसके बाद बीटाडीन / क्लोरहेक्सिडीन, और स्थानीय दर्द नियंत्रण के लिए त्वचा की सतह पर 1% लिडोकेन लागू करें।
- माउस को एक सुपाइन स्थिति में रखें। अंगों और पूंछ को ठीक करने के लिए टेप का उपयोग करें, धीरे से गर्दन की त्वचा को सर्जरी के विपरीत तरफ खींचें। इसके साथ ही, गर्दन को थोड़ा ऊपर उठाएं।
- ऑपरेशन के दौरान आंखों के निर्जलीकरण को रोकने के लिए नेत्र मरहम (जैसे, 5% डेक्सपैंथेनॉल) का उपयोग करें।
2. एसएएच प्रेरण
चित्रा 1: सर्जिकल तकनीक की चरण-दर-चरण छवियां। (ए) उजागर दाहिने कैरोटिड धमनी शरीर रचना विज्ञान का चित्रण: सीसीए और आईसीए और ईसीए में इसके विभाजन की पहचान की जाती है, साथ ही साथ ईसीए (ओए और एसटीए) की छोटी शाखाओं की भी पहचान की जाती है। (बी) ईसीए को आसपास के ऊतकों से जुटाया जाता है और इसे काटने से पहले दो टांके के साथ लिगेट किया जाता है। एक तीसरे बंधाव को विभाजन के पास ढीले ढंग से रखने की आवश्यकता होती है, बिना इसे रोके। (सी) आईसीए और सीसीए को अस्थायी रूप से (या तो बंधाव या क्लिप के साथ) रोक दिया जाता है ताकि अत्यधिक रक्तस्राव को रोका जा सके जब ईसीए को सावधानीपूर्वक शामिल किया जाता है। (घ) फिलामेंट को ईसीए में डाला जाता है और सीसीए में उन्नत किया जाता है। पूर्व-व्यवस्थित बंधाव को सावधानीपूर्वक कड़ा किया जाना चाहिए ताकि कोई रक्त बहाव न हो, लेकिन फिलामेंट को आगे बढ़ाना संभव हो। (ई) आईसीए और सीसीए को फिर से खोल दिया जाता है, और ईसीए स्टंप को कपाल दिशा में समायोजित करने की आवश्यकता होती है। आईसीए में फिलामेंट ~ 9 मिमी को आगे धकेलकर, एसीए-एमसीए विभाजन तक पहुंच जाएगा, और पोत को फिर फिलामेंट ~ 3 मिमी को आगे बढ़ाकर छिद्रित किया जाएगा। (च) सीसीए के अस्थायी पुन: बंधन को सुनिश्चित करने के बाद फिलामेंट को वापस ले लिया जाता है। ईसीए के पूर्व-व्यवस्थित बंधाव को जल्दी से रोक दिया जाता है, और सीसीए को reperfusion की अनुमति देने के लिए फिर से खोल दिया जाता है। संक्षेप: ACA = पूर्वकाल सेरेब्रल धमनी, CCA = आम कैरोटिड धमनी, ECA = बाहरी कैरोटिड धमनी, MCA = मध्य सेरेब्रल धमनी, ICA = आंतरिक कैरोटिड धमनी, OA = पश्चकपाल धमनी, PPA = pterygopalatine धमनी, STA = बेहतर थायराइड धमनी। स्केल बार = 2 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
- एक बाँझ स्केलपेल के साथ गर्दन की त्वचा को खोलें, ठोड़ी से स्तन की हड्डी (1.5 सेमी) के ऊपरी किनारे तक, और उनके आसपास के संयोजी ऊतक से लार ग्रंथियों को स्पष्ट रूप से अलग करें।
- श्वासनली के एक तरफ [इस मामले में, दाईं ओर] मांसपेशियों के समूह को अलग करें, सामान्य कैरोटिड धमनी (सीसीए) म्यान को उजागर करते हुए पौष्टिक रक्त वाहिकाओं और वेन्यूल्स से ढके हुए हैं। सीसीए और वेगल तंत्रिका एक दूसरे के करीब निकटता में स्थित हैं।
- सीसीए को अलग करें और एक मुफ्त 8-0 छोड़ दें सीसीए के चारों ओर रेशम टांका इसे पहले से ही ligating के बिना। वेगल तंत्रिका की सुरक्षा पर ध्यान दें, क्योंकि यह आसानी से क्षतिग्रस्त हो जाता है (चित्रा 1 ए)।
- सीसीए, आईसीए और ईसीए का एक ट्रिपल विभाजन डायस्टेसिस के निचले पश्चवर्ती तीसरे के साथ दिखाई देता है। ईसीए के डिस्टल छोर को विच्छेदित करें और जहाज को दो बार यथासंभव दूरस्थ रूप से लिगेट करें।
- दो बार ligated खंड के मध्य बिंदु पर ईसीए डिस्कनेक्ट करें, एक पोत स्टंप बनाने.
- ईसीए स्टंप के चारों ओर फिलामेंट के लिए एक बंधाव को पूर्व-व्यवस्थित करें, सफल फिलामेंट सम्मिलन तक इसे बंद न करें।
- आईसीए और सीसीए को अस्थायी रूप से रोकने के लिए एक सीवन या माइक्रो क्लिप का उपयोग करें (चित्रा 1 बी)।
- माइक्रोवैस्कुलर कैंची का उपयोग करके ईसीए में एक छोटा चीरा (ईसीए व्यास का लगभग आधा) बनाएं। ईसीए में एक 5-0 (वैकल्पिक रूप से 4-0) प्रोलीन फिलामेंट डालें और इसे सीसीए में आगे बढ़ाएं।
- आईसीए और सीसीए (चित्रा 1 सी) पर माइक्रो क्लिप को ढीला करते समय ईसीए पर लिगेचर को थोड़ा बंद करें।
- धीरे से फिलामेंट पर वापस खींचें और कपाल दिशा में ईसीए स्टंप को समायोजित करें, आईसीए (चित्रा 1 डी) में विभाजन के माध्यम से फिलामेंट को संक्रमित करें।
- फिलामेंट टिप को श्वासनली मध्यरेखा के लिए ~ 30 ° के कोण पर औसत दर्जे का इंगित करें और क्षैतिज विमान के लिए ~ 30 ° । आईसीए के अंदर फिलामेंट को आगे बढ़ाएं। एसीए-एमसीए विभाजन तक पहुंचने के बाद, प्रतिरोध का सामना करना पड़ता है (~ 9 मिमी)।
- फिलामेंट को 3 मिमी आगे बढ़ाएं, सही एसीए को छिद्रित करें। तुरंत ईसीए स्टंप के लिए फिलामेंट वापस ले लो, subarachnoid अंतरिक्ष में रक्त के प्रवाह की अनुमति.
- फिलामेंट को लगभग 10 सेकंड (चित्रा 1 ई) के लिए इस स्थिति में रखें। मांसपेशियों के झटके की उपस्थिति, ipsilateral miosis, सांस के लिए हांफना, परिवर्तित दिल की लय, और मूत्र असंयम सफल सर्जरी के सबूत का समर्थन कर सकते हैं।
- अतिरिक्त रक्त हानि से बचने के लिए सीसीए को अस्थायी रूप से बंद करें। फिलामेंट को तुरंत बाहर निकालें और पूर्व-व्यवस्थित टांके के साथ ईसीए को लिगेट करें। सीसीए को फिर से खोलें और subarachnoid अंतरिक्ष (चित्रा 1F) में reperfusion और रक्त के आगे बहाव की अनुमति दें।
- रक्तस्राव रिसाव की जांच के बाद, पोस्टऑपरेटिव त्वचा संक्रमण को रोकने के लिए घाव के आसपास की त्वचा को कीटाणुरहित करें, और एक गैर-अवशोषित 4-0 पॉलिएस्टर फाइबर टांके के साथ घाव को सीवन करें।
- माउस को एक थर्मल बॉक्स में रखें जब तक कि चेतना वापस नहीं आ जाती। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि जानवर पूरी तरह से जागृत न हो जाए और यह सुनिश्चित करें कि उसने स्टर्नल रिकम्बेंसी बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना हासिल कर ली है। जानवरों को पूरी तरह से ठीक होने तक अन्य चूहों की कंपनी में वापस न करें।
- पश्चात दर्द से राहत के लिए 200-300 मिलीग्राम / किलोग्राम शरीर के वजन पेरासिटामोल का प्रशासन करें।
- सर्जरी के बाद प्रतिदिन चूहों की जांच करें।
3. एमआरआई माप
- सर्जरी के 24 घंटे बाद, एक कृंतक स्कैनर (सामग्री की तालिका) और एक समर्पित माउस हेड गुंजयमान यंत्र का उपयोग करके एमआरआई करें- यहां, एक 20 मिमी संचारित / प्राप्त चतुर्भुज मात्रा गुंजयमान यंत्र का उपयोग किया गया था।
- ~ 37 डिग्री सेल्सियस के एक स्थिर शरीर के तापमान को सुनिश्चित करने के लिए माउस को एक गर्म परिसंचारी पानी के कंबल पर रखें। एक O2 / N2O मिश्रण (30% / 70%) में 2.5% आइसोफ्लुरेन के साथ संज्ञाहरण को प्रेरित करें और निरंतर वेंटिलेशन निगरानी के तहत फेसमास्क के माध्यम से 1.5-2% आइसोफ्लुरेन के साथ बनाए रखें।
- पहले 3 ऑर्थोगोनल स्लाइस पैकेज (त्रि-पायलट-मल्टी, पुनरावृत्ति समय TR / प्रतिध्वनि समय TE = 200 ms / 3 ms, 1 औसत, फ्लिप कोण FA = 30 °, दृश्य FOV के क्षेत्र = 28 मिमी x 28 मिमी, मैट्रिक्स MTX = 256 x 256, टुकड़ा मोटाई 1 मिमी, कुल अधिग्रहण समय TA = 30 s) के साथ फ्लैश प्राप्त करने के लिए एक तेजी से संदर्भ स्कैन प्रदर्शन करें।
- फिर इमेजिंग के लिए एक उच्च रिज़ॉल्यूशन T2-भारित 2D टर्बो स्पिन-इको अनुक्रम का उपयोग करें (इमेजिंग पैरामीटर TR/ TE = 5505 ms/36 ms, RARE factor 8, 6 averages, 46 सन्निहित अक्षीय स्लाइस 0.35 मिमी की स्लाइस मोटाई के साथ पूरे मस्तिष्क को कवर करने के लिए, FOV = 25.6 मिमी x 25.6 मिमी, MTX = 256 x 256, TA = 13 मिनट)।
- यदि परिणाम अस्पष्ट है, तो T2w स्कैन (2D FLASH, TR/TE = 600 ms/6.3 ms, FA = 30°, 1 औसत, 0.35 मिमी मोटाई के साथ 20 अक्षीय स्लाइस, FOV और MTX T2w, TA = 5-10 मिनट श्वसन दर के आधार पर) के समान समान एक अतिरिक्त श्वसन ट्रिगर T2 * भारित ग्रेडिएंट इको अनुक्रम का उपयोग करें।
- DICOM छवि प्रारूप में डेटा स्थानांतरित करें और एसएएच ग्रेडिंग और रक्त के थक्कों की मात्रा के लिए ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें। परिमाणीकरण पर विवरण अनुपूरक सामग्री (अनुपूरक चित्र1) में चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका के रूप में सूचीबद्ध हैं।
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Representative Results
मृत्यु दर
इस अध्ययन के लिए, 8-12 सप्ताह के बीच आयु वर्ग के कुल 92 पुरुष C57Bl / 6J चूहों को एसएएच ऑपरेशन के अधीन किया गया था; इनमें, हमने 11.9% (एन = 12) की समग्र मृत्यु दर देखी। मृत्यु दर विशेष रूप से सर्जरी के बाद पहले 6-24 घंटे के भीतर हुई, जो पेरीऑपरेटिव मृत्यु दर के साथ-साथ एसएएच रक्तस्राव को सबसे अधिक संभावित योगदान कारकों के रूप में बताती है।
एसएएच रक्तस्राव ग्रेड
कुल 50 चूहों ने एसएएच की पुष्टि करने और अन्य सह-होने वाली विकृतियों का पता लगाने को सुनिश्चित करने के लिए एमआरआई 24 घंटे पश्चात प्राप्त किया, जिसमें सबएक्यूट इस्केमिक स्ट्रोक और हाइड्रोसेफलस शामिल हैं। शेष जानवरों का उपयोग पोस्टऑपरेटिव एमआरआई के लिए पर्याप्त समय का चयन करने के लिए पहले के स्कैन के लिए किया गया था। 24 घंटे के समय बिंदु पर 50 जांच किए गए चूहों में से, एन = 7 जानवर जो एसएएच (रक्तस्राव ग्रेड 0) और एन = 5 चूहों को पेश नहीं करते थे, जिनमें अतिरिक्त स्ट्रोक और / या आईसीएच (रक्तस्राव ग्रेड IV) का पता लगाया गया था। एसएएच रक्तस्राव ग्रेड को टी 2 भारित एमआरआई स्कैन के आधार पर निम्नानुसार निर्धारित किया गया था (चित्रा 2 ए, बी):
ग्रेड 0: कोई एसएएच या रक्तस्राव की पहचान नहीं की गई (14%)
ग्रेड I: एसएएच मोटाई ≤0.80 मिमी (24%)
ग्रेड II: एसएएच मोटाई >0.8 और <1.6 मिमी (28%)
ग्रेड III: एसएएच मोटाई ≥1.6 मिमी (24%)
ग्रेड IV: या तो आईसीएच और / या स्ट्रोक (10%) के साथ एसएएच।
चित्रा 2: संबंधित रक्त की मात्रा और एमआरआई छवियों के साथ एसएएच ग्रेडिंग सिस्टम( ए) टी 2-भारित एमआरआई अक्षीय वर्गों में एसएएच ग्रेड को वर्गीकृत करने वाली प्रतिनिधि छवियों को दर्शाया गया है। ग्रेड 0: कोई एसएएच या रक्तस्राव की पहचान नहीं की गई (14%); ग्रेड I: एसएएच मोटाई ≤0.80 मिमी; ग्रेड द्वितीय: एसएएच मोटाई >0.8 और <1.6 मिमी; ग्रेड III: एसएएच मोटाई ≥1.6 मिमी; ग्रेड IV: या तो आईसीएच और / या स्ट्रोक के साथ एसएएच। (बी) प्रायोगिक चूहों में एसएएच ग्रेड के वितरण को दर्शाने वाला पाई चार्ट। (C,E) सूत्र V = A1 + A 2 + ... + A x) के आधार पर परिकलित SAH रक्तस्राव आयतन · डी, जिसके द्वारा रक्तस्राव क्षेत्र प्रत्येक स्लाइड अनुभाग पर ImageJ के माध्यम से निर्धारित किया जाता है, और सभी रक्तस्राव क्षेत्रों का योग संबंधित एमआरआई स्लाइड मोटाई के साथ गुणा किया जाता है। (घ) कोठारी एबीसी/2 आयतन अनुमान के आधार पर प्रत्येक एसएएच गे्रड की कुल रक्तस्राव मात्रा। मानों को SEM ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है। संक्षेप: ICH = इंट्रासेरेब्रल हेमरेज, MRI = चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग। स्केल बार = 5 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
खून बह रहा मात्रा
ग्रेड I-III के लिए, रक्तस्राव की मात्रा को दो अलग-अलग तरीकों से निर्धारित किया गया था:
विधि ए: रक्तस्राव की कुल मात्रा की गणना कैथरी एट अल द्वारा एबीसी / 2 वॉल्यूम अनुमान के आधार पर की गई थी, अंडाकार मात्रा के लिए समीकरण का एक संशोधन जो आईसीएच वॉल्यूम (चित्रा 2 डी) 20 का अनुमान लगाने के लिए नैदानिक सेटिंग में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है।
विधि B: परिकलित SAH रक्तस्राव आयतन का अनुमान सूत्र V = (A1 + A2 + ... + Ax) के आधार पर लगाया गया था · d, जिसके द्वारा प्रत्येक स्लाइड अनुभाग पर ImageJ के माध्यम से रक्तस्राव क्षेत्र निर्धारित किया गया था और सभी रक्तस्राव क्षेत्रों का योग संबंधित एमआरआई स्लाइड मोटाई के साथ गुणा किया गया था ('A i' स्लाइस 'i' पर रक्तस्राव क्षेत्र से मेल खाता है, 'x' स्लाइस की कुल संख्या है, 'd' स्लाइस मोटाई से मेल खाती है)। इस विधि ने आकार की अनियमितता को ध्यान में रखा (चित्रा 2 सी, ई)। अपेक्षित रूप से, विधि B ने प्रत्येक उपसमूह में मानों की एक बड़ी श्रृंखला दिखाई। हालांकि, दोनों विधियों ने संबंधित रक्तस्राव ग्रेड में एक महत्वपूर्ण अंतर दिखाया जो अक्षीय एसएएच मोटाई पर आधारित थे और निम्नलिखित पैराग्राफ में वर्णित हैं। अनुपूरक चित्रा 2 सभी उपसमूहों के एसएएच वॉल्यूम को दर्शाता है; अपेक्षित रूप से, ग्रेड IV विषम प्रकृति का था क्योंकि इसमें सह-होने वाले आईसीएच भी शामिल थे।
सांख्यिकीय विश्लेषण और आंकड़े
सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए GraphPad प्रिज्म का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था। एक तरफ़ा एनोवा विश्लेषण का उपयोग कई समूहों की तुलना करने के लिए किया गया था। मानक त्रुटियों ± साधन के रूप में मान प्रदर्शित किए जाते हैं और p < 0.05 के p-मानों को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। चित्र 1 और चित्रा 2 के तत्वों को BioRender.com का उपयोग करके बनाया गया था।
पूरक चित्रा 1: ImageJ के साथ खून बह रहा मात्रा को परिमाणित करने के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका। ImageJ के साथ छवियों को आयात करें, और आयामी डेटा दिखाने के लिए "Strg + I" दर्ज करें। फिर छवि के लिए पैमाने सेट करें। उन सभी छवियों की पहचान करें जिनमें एसएएच को देखा जा सकता है। विधि ए के लिए, सबसे बड़े रक्तस्राव क्षेत्र के साथ स्लाइस की पहचान करें और क्रैनियोकैडल लंबाई (= ए) के साथ-साथ दो ऑर्थोगोनल अक्षों की औसत दर्जे की लंबाई (= बी) को मापें जो अंडाकार एसएएच वॉल्यूम को फैलाते हैं। अंडाकार आकार के वेंट्रोडोर्सल आयाम (= सी) का अनुमान स्लाइस की मोटाई और स्लाइस की संख्या के आधार पर लगाया जा सकता है जिस पर एसएएच देखा जाता है [सी = स्लाइस मोटाई एक्स स्लाइस की संख्या]। सूत्र के आधार पर आयतन की गणना करें: V = abc/2. विधि B के लिए, प्रत्येक स्लाइस पर रक्तस्राव क्षेत्रों को अलग से मापें और फिर सूत्र के आधार पर आयतन की गणना करें: V = (A1 + A2 + ... + Ax) · d, जिसके द्वारा d = स्लाइस मोटाई। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
पूरक चित्रा 2: सभी उपसमूहों के खून बह रहा मात्रा. (ए) सूत्र V = abc/2 का उपयोग करके विधि A के आधार पर प्रत्येक उपसमूह में रक्तस्राव की मात्रा (मिमी3)। (B) विधि B (सूत्र V = (A1 + A 2 + ... + A x) का उपयोग करके संबंधित उपसमूहों के रक्तस्राव की मात्रा (मिमी3) · घ; d = टुकड़ा मोटाई)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
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Discussion
संक्षेप में, एंडोवैस्कुलर फिलामेंट वेध ऑपरेशन द्वारा प्रेरित एक मानकीकृत एसएएच माउस मॉडल को मामूली आक्रमण, कम ऑपरेटिव समय और स्वीकार्य मृत्यु दर के साथ प्रस्तुत किया जाता है। एमआरआई सही रक्तस्राव साइट और अन्य प्रासंगिक इंट्राक्रैनियल विकृति के बहिष्करण को सुनिश्चित करने के लिए 24 घंटे पश्चात आयोजित किया जाता है। इसके अलावा, हमने विभिन्न एसएएच रक्तस्राव ग्रेड को वर्गीकृत किया और रक्तस्राव की मात्रा को मापा, जिससे रक्तस्राव ग्रेड के आधार पर आगे उपसमूह विश्लेषण की अनुमति मिलती है।
माउस की पर्याप्त स्थिति सही छिद्र की सफलता को प्रभावित करती है। माउस की गर्दन को ऑपरेशन के विपरीत तरफ थोड़ा फैलाया जाना चाहिए, जिसमें सिर थोड़ा ऊंचा हो। यह ट्राइफरकेशन को उजागर करता है और पंचर पथ को आसान सुलभ बनाता है। यदि फिलामेंट का आगे बढ़ना विफल हो जाता है, तो फिलामेंट को थोड़ा सा ट्राइफरकेशन में वापस लेना और सिर की स्थिति को समायोजित करना सहायक हो सकता है जब तक कि बिना किसी प्रतिरोध के आगे बढ़ना संभव न हो।
अंतःक्रियात्मक तंत्रिका संरक्षण महत्वपूर्ण है। वेगल तंत्रिका और गर्भाशय ग्रीवा जाल की गड़बड़ी श्वसन और हृदय लय में परिवर्तन का कारण बन सकती है, और कुछ चूहों की घातक अतालता के कारण भी मृत्यु हो सकती है। यदि ये लक्षण होते हैं, तो सांस लेने और हृदय गति स्थिर होने तक कुछ मिनटों के लिए प्रक्रिया को रोकना आवश्यक है।
चूहों के अस्तित्व में सुधार के लिए इंट्राऑपरेटिव रक्त की हानि को कम करना महत्वपूर्ण है। हमारे अनुभव के आधार पर, डबल सीवन बंधाव सबसे अच्छा ECA के करीब लागू किया जाता है। हम डिस्टल ईसीए स्टंप से रक्त बैकफ्लो को रोकने के लिए दो लिगेशन के बीच में ईसीए को डिस्कनेक्ट करते हैं। जब फिलामेंट को ईसीए में डाला जाता है, तो चीरा से रक्त बहाव को रोकने के लिए पूर्व-व्यवस्थित सीवन को लिगेट किया जाना चाहिए। पोत को बहुत कसकर नहीं खोदना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह उचित फिलामेंट प्रगति में बाधा डालता है।
फिलामेंट सम्मिलन की उचित गहराई सफल एसएएच प्रेरण के लिए आवश्यक है। उपयोग किए गए चूहों की उम्र (8-12 सप्ताह) के कारण, हम आईसीए के अंदर फिलामेंट ~ 9 मिमी डालते हैं और प्रतिरोध का सामना करने पर रोकते हैं, फिर छिद्र के लिए ~ 3 मिमी आगे बढ़ते हैं। फिलामेंट को पर्याप्त गहरा नहीं डालने से अपर्याप्त छिद्र हो सकता है, जिससे कोई एसएएच नहीं हो सकता है, जबकि अत्यधिक सम्मिलन स्ट्रोक और / या आईसीएच (चित्रा 3) का कारण बन सकता है। उसी समय, चूहों की मूल शरीर रचना और संवहनी संरचनाओं को ऑपरेशन के दौरान यथासंभव संरक्षित करने की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, ओसीसीपटल धमनी (ओए) या बेहतर थायरॉयड धमनी (एसटीए), और म्यान पर पोषण रक्त वाहिकाओं को यथासंभव बनाए रखा जाना चाहिए।
चित्रा 3: माउस मस्तिष्क शरीर रचना विज्ञान और एसएएच की मैक्रोस्कोपिक छवियां। (ए) फिलामेंट वेध की साइट को दर्शाने वाली योजनाबद्ध माउस संवहनी शरीर रचना विज्ञान। (बी) एसएएच के सफल प्रेरण की शास्त्रीय मैक्रोस्कोपिक छवि। मस्तिष्क को हटाने से पहले, 1x PBS का एक छिड़काव किया गया था। (सी) माउस का मैक्रोस्कोपिक दृश्य जिसमें फिलामेंट को बहुत गहरा धक्का दिया गया था, जिससे आईसीएच होता है। संक्षेप: ACA = पूर्वकाल सेरेब्रल धमनी, ECA = बाहरी कैरोटिड धमनी, CCA = सामान्य कैरोटिड धमनी, ICA = आंतरिक कैरोटिड धमनी, ICH = इंट्रासेरेब्रल हेमरेज, L = बाएं, एमसीए = मध्य सेरेब्रल धमनी, PPA = pterygopalatine धमनी, R = दाएँ। स्केल बार = 3 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
एंडोवैस्कुलर वेध मॉडल एसएएच का अध्ययन करने के लिए एक आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला पशु मॉडल है, लेकिन रक्तस्राव ग्रेड सुनिश्चित करने और स्ट्रोक या इंट्रासेरेब्रल रक्तस्राव जैसे अन्य विकृतियों को बाहर करने के साधन साहित्य21 में पर्याप्त रूप से मानकीकृत नहीं हैं। किसी भी ऑपरेटिव पशु मॉडल की तरह, एसएएच प्रेरण की सफलता दर और मजबूती सर्जन के अनुभव पर निर्भर करती है।
वर्तमान में, एंडोवैस्कुलर वेध मॉडल चूहों में प्रयोगात्मक एसएएच प्रेरण के सबसे लोकप्रिय तरीकों में से एक है। इस दृष्टिकोण को क्रैनियोटॉमी की आवश्यकता नहीं होती है और एन्यूरिज्मल एसएएच22 से पीड़ित मनुष्यों में होने वाली प्रक्रियाओं से सटीक रूप से मिलता-जुलता है। लाभ ों में एन्यूरिज्मल एसएएच के बाद पैथोफिजियोलॉजी की करीबी नकल शामिल है, जो तीव्र और विलंबित प्रतिक्रियाओं के बारे में23 है। इसके अतिरिक्त, इस मॉडल में मृत्यु दर को एन्यूरिज्मल एसएएच23 से पीड़ित रोगियों में नैदानिक अध्ययनों के समान दिखाया गया है। रक्त इंजेक्शन मॉडल की तुलना में, रक्त-मस्तिष्क बाधा पारगम्यता में परिवर्तन अधिक बारीकी से नकल की जाती है, और फिलामेंट वेध11,24 में वासोस्पास्म की उच्च दर प्राप्त की जाती है। रक्त इंजेक्शन मॉडल अधिक आक्रामक होते हैं और इसलिए कम आक्रामक एंडोवैस्कुलर छिद्र मॉडल की तुलना में ऊतक क्षति के लिए अधिक जोखिम पैदा करते हैं। फिर भी, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि रक्त इंजेक्शन विधियों का एक प्रमुख लाभ आसानी से नियंत्रित रक्त की मात्रा23 है। इंजेक्शन की गति के मानकीकरण पर विचार करना महत्वपूर्ण है क्योंकि आईसीपी के परिवर्तन इंजेक्शन23 की गति पर बहुत अधिक निर्भर हैं। इन शास्त्रीय मॉडलों के अलावा, एकतरफा nephrectomy द्वारा एन्यूरिज्म गठन और उच्च रक्तचाप को प्रेरित करने के लिए इलास्टेज इंजेक्शन का संयोजन, अंततः एन्यूरिज्म टूटना के लिए अग्रणी, एक अधिक pathophysiologically यथार्थवादी सेटिंग25 में subarachnoid रक्तस्राव का अध्ययन करने के लिए एक दिलचस्प मॉडल बनाता है। आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के साथ ऐसी तकनीकों को एकीकृत करना भविष्य के अध्ययनों के लिए रुचि का होगा।
फिलामेंट वेध मॉडल के लिए पिछले एसएएच ग्रेडिंग सिस्टम माउस की बलि दिए जाने के बाद विभिन्न मस्तिष्क खंडों में दृश्यमान सबराक्नोइड रक्त की मात्रा पर आधारित हैं। नतीजतन, ये ग्रेडिंग सिस्टम दीर्घकालिक अध्ययन की अनुमति नहीं देते हैं जब रक्त को बलिदान के समय पहले से ही रिसॉर्ब किया गया है। नैदानिक सेटिंग में, एसएएच को नैदानिक प्रस्तुति के साथ-साथ इमेजिंग पर एसएएच मोटाई के आधार पर वर्गीकृत किया जाता है, जो नैदानिक परिणाम 1,26,27,28 के अनुरूप होता है। इसलिए, रक्तस्राव की गंभीरता को noninvasively वर्गीकृत करने के प्रयास में, हमने एसएएच रेडियोग्राफिक रूप से ग्रेड करने के लिए एक मानकीकृत एमआरआई अनुवर्ती परीक्षा को जोड़ा, जिसके द्वारा ग्रेडिंग पहले से मौजूद मानव ग्रेडिंग तराजू पर आधारित थी, जो एगशिरा एट अल.18 द्वारा एसएएच चूहों में पहले से प्रकाशित एमआरआई ग्रेडिंग सिस्टम की ग्रेडिंग प्रणाली को अनुकूलित करती थी। यह दृष्टिकोण कुल रक्त की मात्रा का परिमाणीकरण और अन्य सह-होने वाले इंट्राक्रैनियल पैथोलॉजी (जैसे, स्ट्रोक, आईसीएच, हाइड्रोसेफलस) के साथ जानवरों के बहिष्करण को भी सुनिश्चित करता है। कुछ अध्ययनों ने सफल एसएएच प्रेरण के सबूत के रूप में इंट्राक्रैनियल प्रेशर (आईसीपी), सेरेब्रल परफ्यूजन और रक्तचाप की निगरानी का प्रस्ताव दिया, जो अतिरिक्त सहायक उपकरणहो सकता है। एसएएच की गंभीरता और संभावित इंट्रापेरेन्काइमल क्षति को ग्रेड करने के अप्रत्यक्ष तरीकों में सेल डेथ मार्करों जैसे कि p53, TUNEL या 3 के लिए हिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग के साथ नैदानिक निष्कर्षों का संयोजन शामिल है। हालांकि, आईसीपी निगरानी के साथ-साथ न्यूरोलॉजिकल जैसे इन अप्रत्यक्ष उपकरणों को बड़े करीने से स्ट्रोक, इंट्राक्रैनियल रक्तस्राव, या हाइड्रोसेफलस जैसे अन्य विकृतियों में अंतर नहीं किया जा सकता है। एमआरआई ग्रेडिंग के फायदों के बावजूद, इसकी व्यवहार्यता के बारे में इस दृष्टिकोण का एक बड़ा दोष है: एमआरआई अन्य तरीकों के रूप में प्रयोगशालाओं के लिए व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं है। यह प्रयोगात्मक एसएएच में एमआरआई ग्रेडिंग सिस्टम की व्यापक शुरुआत को सीमित करता है। उपलब्ध होने पर, हालांकि, प्रस्तुत एमआरआई ग्रेडिंग सिस्टम प्रयोगात्मक एसएएच मॉडल को मानकीकृत करने के लिए एक उपकरण जोड़ता है, इसलिए प्रयोगों की पुनरुत्पादन और तुलनात्मकता की सुविधाप्रदान करता है। इस अध्ययन में, ऑपरेशन के दौरान देखे गए नैदानिक परिवर्तनों के बावजूद, पोस्टऑपरेटिव एमआरआई पर एसएएच के सबूत के बिना चूहों की 14% दर अभी भी थी। संभवतः, इस उपसमूह में चूहों को माइक्रोहेमोररेज से पीड़ित था, जो एमआरआई पर पता लगाने योग्य नहीं था (नकारात्मक सीटी वाले एसएएच रोगियों के समान लेकिन काठ का पंचर में ज़ैंथोक्रोमिया की उपस्थिति)। इन चूहों को आगे के विश्लेषण के लिए इस प्रयोगात्मक सेटअप में बाहर रखा गया था। एमआरआई पर इन "नो-ब्लीड्स" का तकनीकी कारण अपर्याप्त फिलामेंट सम्मिलन हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप कोई छिद्र नहीं हो सकता है (उदाहरण के लिए, ओए या पेटरीगोपैलेटिन धमनी (पीपीए) में गलत प्लेसमेंट द्वारा)। इसके अतिरिक्त, सफलतापूर्वक छिद्रित पोत फिलामेंट की वापसी के बाद फिर से बंद हो सकता है, एसएएच को रोक सकता है।
संक्षेप में, एंडोवैस्कुलर वेध द्वारा प्रयोगात्मक एन्यूरिज्मल एसएएच के लिए एक मानकीकृत मॉडल प्रस्तुत किया गया है, जो रक्तस्राव की पुष्टि और ग्रेड करने और अन्य प्रासंगिक इंट्राक्रैनियल विकृति को बाहर करने के लिए सर्जरी के बाद एमआर इमेजिंग 24 घंटे के साथ संयुक्त है।
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Disclosures
हितों का टकराव नहीं
Acknowledgments
SL चीनी छात्रवृत्ति परिषद द्वारा समर्थित किया गया था। KT बर्लिन इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ और Sonnenfeld-Stiftung के BIH-MD छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित था। RX BIH-Charité Clinician Scientist Program द्वारा समर्थित है, जिसे Charité-Universitätsmedizin बर्लिन और बर्लिन इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। हम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG) और Charité के ओपन एक्सेस पब्लिकेशन फंड से समर्थन स्वीकार करते हैं - Universitätsmedizin बर्लिन।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eye cream | Bayer | 815529836 | Bepanthen |
| Images analysis software | ImageJ | Bundled with Java 1.8.0_172 | |
| Ligation suture (5-0) | SMI | Silk black USP | |
| Light source for microscope | Zeiss | CL 6000 LED | |
| Ketamine | CP-pharma | 797-037 | 100 mg/mL |
| MRI | Bruker | Pharmascan 70/16 | 7 Tesla |
| MRI images acquired software | Bruker | Bruker Paravision 5.1 | |
| Paracetamol (40 mg/mL) | bene Arzneimittel | 4993736 | |
| Prolene filament (5-0) | Erhicon | EH7255 | |
| Razor | Wella | HS61 | |
| Surgical instrument (Fine Scissors) | FST | 14060-09 | |
| Surgical instrument (forceps#1) | AESCULAP | FM001R | |
| Surgical instrument (forceps#2) | AESCULAP | FD2855R | |
| Surgical instrument (forceps#3) | Hammacher | HCS 082-12 | |
| Surgical instrument (Needle holder) | FST | 91201-13 | |
| Surgical instrument (Vannas Spring Scissors) | FST | 15000-08 | |
| Surgical microscope | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Ventilation monitoring | Stony Brook | Small Animal Monitoring & Gating System | |
| Wounding suture(4-0) | Erhicon | CB84D | |
| Xylavet | CP-pharma | 797-062 | 20 mg/mL |
References
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