精密医療ツールとしての膀胱癌オルガノイドの培養
Summary
患者由来のオルガノイド(PDO)は、トランスレーショナルがん研究における強力なツールであり、疾患の遺伝的および表現型的な不均一性および個別化抗がん治療に対する応答の両方を反映しています。ここでは、表現型解析および薬物応答の評価に備えてヒト原発性膀胱癌PDOを生成するための統合プロトコールが詳述されている。
Abstract
現在の インビトロ 治療試験プラットフォームは、腫瘍病態生理学との関連性を欠いており、典型的には、組織培養プラスチック上の二次元(2D)培養物として確立された癌細胞株を使用する。治療応答と感受性を正確に予測できる腫瘍の複雑さのより代表的なモデルが決定的に必要とされています。新鮮な腫瘍組織に由来する患者由来オルガノイド(PDO)の三次元(3D) エクスビボ 培養の開発は、これらの欠点に対処することを目的としている。オルガノイド培養物は、日常的な臨床管理と並行して腫瘍の代理として使用でき、潜在的な効果的な介入を特定し、無駄である可能性のある治療法を示すことによって、治療上の決定に情報を提供することができます。ここで、この手順は、新鮮で生存可能な臨床組織から膀胱癌PDOを確立するための戦略および詳細なステップバイステッププロトコルを記述することを目的としている。当社の十分に確立された最適化されたプロトコルは、患者から直接得られた限定的で多様な出発物質または患者由来の異種移植片(PDX)腫瘍材料を使用して実験用の3D培養をセットアップするのに実用的です。この手順は、標準的な組織培養装置を備えたほとんどの研究室でも採用できます。このプロトコルを使用して生成されたオルガノイドは、泌尿器科的癌病理を支える分子メカニズムを理解し、臨床管理に情報を提供する治療法を評価するために 、ex vivo 代理として使用することができる。
Introduction
膀胱癌は、最も蔓延している尿路癌であり、世界で10番目に多いヒト悪性腫瘍である1.それは、疾患2の遺伝的に多様で表現型的に複雑なスペクトルを包含する。尿路上皮非筋肉浸潤型膀胱癌(NMIBC)は、最も一般的な膀胱癌の診断(70%〜80%)であり、これらの癌はかなりの生物学的不均一性および可変臨床転帰を示す2,3,4。NMIBC患者は、通常、疾患再発のリスクが高く(50〜70%)、がんの3分の1が進行し、有意に攻撃的な筋肉浸潤性膀胱がん(MIBC)に発展する2。NMIBCの5年生存率は高い(>90%)が、これらの患者は長期的な臨床管理を受けなければならない5。一方、局所的に進行した(切除不能な)または転移性MIBCは、一般に不治の病であると考えられる6。その結果、膀胱癌は、癌治療の中で最も高い生涯治療費の1つであり、個人および医療システムの両方にとって大きな負担である3,7。進行性疾患における根底にある遺伝子異常は、膀胱癌の治療管理を臨床的課題とし、浸潤性尿路上皮腫瘍の治療選択肢は、進行性および高リスクNMIBC 8,9の両方に対する免疫療法の承認以来、ごく最近改善された。現在、臨床的意思決定は、個々の膀胱癌腫瘍が疾患攻撃性および治療に対する応答に大きな差を示すにもかかわらず、従来の臨床的および組織病理学的特徴によって導かれている10。個々の患者の予後の予測と効果的な治療法の同定を改善するために、臨床的に有用なモデルの研究を加速することが急務である。
3次元(3D)オルガノイドは、元の腫瘍の固有のin vivoアーキテクチャおよび薬理ゲノムプロファイルを自己組織化および反復する能力、およびそれらが由来する元の組織の天然の細胞機能を反映する能力のために、腫瘍モデルとして大きな可能性を示す11,12,13.確立された膀胱癌細胞株は容易に入手可能であり、比較的費用対効果が高く、スケーラブルで、操作が簡単であるが、in vitro細胞株は、臨床膀胱癌12、14で観察される多様な遺伝的およびエピジェネティックな変化のスペクトルを模倣することにほとんど失敗し、すべて2Dの付着培養条件下で樹立および維持された。さらに、原発性および転移性膀胱腫瘍に由来する細胞株は、元の腫瘍材料から有意な遺伝的相違を有する。8,15。
別のアプローチは、遺伝子操作された発癌物質誘導マウスモデルを使用することである。しかし、これらのモデルは、ヒト新生物形成に関与する天然の発癌性カスケードのいくつかを再現しているが(参考文献16,17,18でレビュー)、腫瘍の不均一性を欠いており、高価であり、浸潤性および転移性膀胱癌をり表さず、腫瘍が発症するのに数ヶ月かかる可能性があるため、迅速な薬物検査には実行可能ではない14,19.がんの患者由来モデル(オルガノイド、条件付き再プログラム初代細胞培養、および異種移植片を含む)は、臨床治療前の薬物治療の効果を理解するための非常に貴重な機会を提供する20。それにもかかわらず、新鮮な一次患者組織へのアクセスが限られており、患者由来オルガノイド(PDO)培養条件を再現性よく生成するために必要な広範な最適化のために、これらの患者近位モデルを日常的に使用するグループはほとんどありません。in vivoの設定において、発癌性細胞は、間質細胞、組織浸潤免疫細胞、およびマトリックス12を含む周囲の構成成分の様々な組成物と相互作用し、通信することができる。同様に、3D形式で成長したPDOの場合、セルラー/マトリックスの複雑さをカスタマイズして、他の関連コンポーネントを含めることができます。PDOは迅速に生成することができ、有限の寿命を有するにもかかわらず、しばしば広範囲に継代または後で使用するために凍結保存することができる21、22、23。薬力学(すなわち、薬物に対する応答)は、オルガノイドの生存率および形態、ならびに免疫組織化学標的または転写変化の特性評価を含む複数の読み出しを用いて評価することができる。
ここでは、膀胱腫瘍の経尿道的切除(TURBT)または膀胱の外科的除去(根治的膀胱切除術)から採取された患者材料からの膀胱癌オルガノイドの確立のための手順が記載されている。PDOを生成する方法は、容易に入手可能な湿式実験材料およびツールを使用して例示される。エンドポイントには、細胞形態学的特性および生存率の変化が含まれる。これらは、蛍光顕微鏡、 インビトロ 生存率(代謝および細胞膜完全性)アッセイ、および組織病理学的分析を用いて測定した。 図1 は、選択的手術中に得られた臨床材料からヒト膀胱癌PDOを確立するためのワークフローを示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
膀胱癌組織に由来する3Dオルガノイドプロトコルはまだ初期段階にありますが、活発な研究と臨床研究の分野です。ここでは、NMIBC検体とMIBC検体の両方に適した膀胱癌PDOを首尾よく確立するための最適化されたプロトコルが詳述されている。このワークフローは、病院ベースの臨床試験に並行して統合され、組織学的サンプル処理や臨床オルガノイドパイプラインの重要な考慮事項である新?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、トランスレーショナル・リサーチ・インスティテュート組織学コア・生物資源ファシリティの技術支援を認める。この研究は、プリンセス・アレクサンドラ・リサーチ・ファウンデーション賞(I.V.、E.D.W.)および医学研究未来基金(MRFF)ラピッド・アプライド・リサーチ・トランスレーション・プログラム(Center for Personalized Analysis of Cancers(CPAC;E.D.W.、I.V.)。トランスレーショナル・リサーチ・インスティテュートはオーストラリア政府から支援を受けています。
Materials
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
- Saginala, K., et al. Epidemiology of bladder cancer. Medical Sciences. 8 (1), 15 (2020).
- Lindskrog, S. V., et al. An integrated multi-omics analysis identifies prognostic molecular subtypes of non-muscle-invasive bladder cancer. Nature Communications. 12 (1), 2301 (2021).
- Isharwal, S., Konety, B. Non-muscle invasive bladder cancer risk stratification. Indian Journal of Urology. 31 (4), 289-296 (2015).
- Lozano, F., Raventos, C. X., Carrion, A., Trilla, E., Morote, J. Current status of genetic urinary biomarkers for surveillance of non-muscle invasive bladder cancer: a systematic review. BMC Urology. 20 (1), 99 (2020).
- Batista, R., et al. TERT promoter mutation as a potential predictive biomarker in bcg-treated bladder cancer patients. Internation Journal of Molecular Science. 21 (3), 947 (2020).
- Patel, V. G., Oh, W. K., Galsky, M. D. Treatment of muscle-invasive and advanced bladder cancer in 2020. Cancer Journal for Clinicians. 70 (5), 404-423 (2020).
- Williams, S. B., et al. Estimated costs and long-term outcomes of patients with high-risk non-muscle-invasive bladder cancer treated with bacillus calmette-guérin in the veterans affairs health system. JAMA Network Open. 4 (3), 213800 (2021).
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- lvarez-Maestro, M., Guerrero-Ramos, F., Rodríguez-Faba, O., Domínguez-Escrig, J. L., Fernández-Gómez, J. M. Current treatments for BCG failure in non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). Actas Urológicas Españolas (English Edition). 45 (2), 93-102 (2021).
- Berry, D. L., et al. Treatment decision making in patients with bladder cancer. Bladder Cancer. 1 (2), 151-158 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Kato, M., Sasaki, T., Inoue, T. Current experimental human tissue-derived models for prostate cancer research. International Journal of Urology. 28 (2), 150-162 (2021).
- Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
- Joshi, A., Roberts, M. J., Alinezhad, S., Williams, E. D., Vela, I. Challenges, applications and future directions of precision medicine in prostate cancer – the role of organoids and patient-derived xenografts. British Journal of Urology International. 126 (1), 65-72 (2020).
- Pan, C. X., et al. Development and characterization of bladder cancer patient-derived xenografts for molecularly guided targeted therapy. PLoS One. 10 (8), 0134346 (2015).
- Gopinathan, A., Tuveson, D. A. The use of GEM models for experimental cancer therapeutics. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 83-86 (2008).
- Kemp, C. J. Animal models of chemical carcinogenesis: driving breakthroughs in cancer research for 100 years. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (10), 865-874 (2015).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Liu, W., et al. Conditional reprogramming: Modeling urological cancer and translation to clinics. Clinical Translational Medicine. 10 (2), 95 (2020).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematological Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Kim, I. H., Lee, H. J. Perioperative immunotherapy for muscle-invasive bladder cancer. Translational Andrology and Urology. 9 (6), 2976-2985 (2020).
- Raphael, M. J., Booth, C. M. Neoadjuvant chemotherapy for muscle-invasive bladder cancer: Underused across the 49(th) parallel. Canadian Urological Association Journal. 13 (2), 29-31 (2019).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models. Journal of Visualized Experiments. (155), e60364 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Fusco, P., et al. Patient-derived organoids (PDOs) as a novel in vitro model for neuroblastoma tumours. BMC Cancer. 19 (1), 970 (2019).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Vasyutinv, I., Zerihun, L., Ivan, C., Atala, A. Bladder organoids and spheroids: potential tools for normal and diseased tissue modelling. Anticancer Research. 39 (3), 1105-1118 (2019).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49fhigh mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communications. 10 (1), 4407 (2019).
- Whyard, T., Liu, J., Darras, F. S., Waltzer, W. C., Romanov, V. Organoid model of urothelial cancer: establishment and applications for bladder cancer research. Biotechniques. 69 (3), 193-199 (2020).
