Cultivo de organoides del cáncer de vejiga como herramientas de medicina de precisión
Summary
Los organoides derivados del paciente (DOP) son una herramienta poderosa en la investigación traslacional del cáncer, que refleja tanto la heterogeneidad genética y fenotípica de la enfermedad como la respuesta a las terapias personalizadas contra el cáncer. Aquí, se detalla un protocolo consolidado para generar DOP de cáncer de vejiga primario humano en preparación para la evaluación de análisis fenotípicos y respuestas a medicamentos.
Abstract
Las plataformas actuales de pruebas terapéuticas in vitro carecen de relevancia para la fisiopatología tumoral, generalmente empleando líneas celulares de cáncer establecidas como cultivos bidimensionales (2D) en plástico de cultivo de tejidos. Existe una necesidad crítica de modelos más representativos de la complejidad tumoral que puedan predecir con precisión la respuesta terapéutica y la sensibilidad. El desarrollo del cultivo tridimensional (3D) ex vivo de organoides derivados de pacientes (PDO), derivados de tejidos tumorales frescos, tiene como objetivo abordar estas deficiencias. Los cultivos de organoides se pueden utilizar como sustitutos tumorales en paralelo al tratamiento clínico de rutina para informar las decisiones terapéuticas mediante la identificación de posibles intervenciones efectivas e indicando terapias que pueden ser inútiles. Aquí, este procedimiento tiene como objetivo describir estrategias y un protocolo detallado paso a paso para establecer PDO de cáncer de vejiga a partir de tejido clínico fresco y viable. Nuestros protocolos bien establecidos y optimizados son prácticos para configurar cultivos 3D para experimentos utilizando material de partida limitado y diverso directamente de pacientes o material tumoral de xenoinjerto derivado del paciente (PDX). Este procedimiento también puede ser empleado por la mayoría de los laboratorios equipados con equipos estándar de cultivo de tejidos. Los organoides generados utilizando este protocolo se pueden utilizar como sustitutos ex vivo para comprender tanto los mecanismos moleculares que sustentan la patología urológica del cáncer como para evaluar los tratamientos para informar el manejo clínico.
Introduction
El cáncer de vejiga es el cáncer del tracto urinario más prevalente y la décima neoplasia maligna humana más común en todo el mundo1. Abarca un espectro de enfermedad genéticamente diverso y fenotípicamente complejo2. Las formas uroteliales no invasivas musculares de cáncer de vejiga (NMIBC) son los diagnósticos de cáncer de vejiga más comunes (70%-80%), y estos cánceres muestran una heterogeneidad biológica considerable y resultados clínicos variables 2,3,4. Los pacientes con NMIBC generalmente experimentan un alto riesgo de recurrencia de la enfermedad (50-70%) y un tercio de los cánceres progresarán y se convertirán en cáncer de vejiga invasivo muscular (MIBC) significativamente más agresivo.2. Aunque las tasas de supervivencia a 5 años para NMIBC son altas (>90%), estos pacientes deben someterse a un tratamiento clínico a largo plazo5. Por otro lado, el MIBC localmente avanzado (irresecable) o metastásico generalmente se considera incurable6. En consecuencia, el cáncer de vejiga tiene uno de los costos de tratamiento de por vida más altos dentro de la atención del cáncer y es una carga significativa tanto para el individuo como para el sistema de salud 3,7. Las aberraciones genéticas subyacentes en la enfermedad avanzada hacen que el manejo terapéutico del cáncer de vejiga sea un desafío clínico, y las opciones terapéuticas para los tumores uroteliales invasivos solo han mejorado recientemente desde la aprobación de inmunoterapias para NMIBC avanzado y de alto riesgo 8,9. Actualmente, la toma de decisiones clínicas se ha guiado por características clínicas e histopatológicas convencionales, a pesar de que los tumores individuales de cáncer de vejiga muestran grandes diferencias en la agresividad de la enfermedad y la respuesta a la terapia10. Existe una necesidad urgente de acelerar la investigación de modelos clínicamente útiles para mejorar la predicción del pronóstico individual del paciente y la identificación de tratamientos efectivos.
Los organoides tridimensionales (3D) muestran un gran potencial como modelos tumorales debido a su capacidad para autoorganizarse y recapitular la arquitectura in vivo intrínseca y el perfil farmacogenómico del tumor original, y su capacidad para reflejar la funcionalidad celular nativa del tejido original del que se derivaron 11,12,13 . Aunque las líneas celulares de cáncer de vejiga establecidas están fácilmente disponibles, son relativamente rentables, escalables y fáciles de manipular, las líneas celulares in vitro en gran medida no logran imitar el espectro de diversas alteraciones genéticas y epigenéticas observadas en los cánceres clínicos de vejiga12,14 y todas se establecieron y mantuvieron bajo condiciones de cultivo adherentes 2D. Además, las líneas celulares derivadas de tumores de vejiga primarios y metastásicos albergan una divergencia genética significativa del material tumoral original. 8,15.
Un enfoque alternativo es utilizar modelos de ratón genéticamente modificados e inducidos por carcinógenos. Sin embargo, si bien estos modelos recapitulan algunas de las cascadas oncogénicas naturales involucradas en la neoplasia humana (revisadas en refs 16,17,18), carecen de heterogeneidad tumoral, son costosas, representan mal el cáncer de vejiga invasivo y metastásico, y no son viables para las pruebas de drogas a término rápido, ya que los tumores pueden tardar muchos meses en desarrollarse 14,19 . Los modelos de cáncer derivados de pacientes (incluidos los organoides, el cultivo celular primario reprogramado condicionalmente y los xenoinjertos) brindan oportunidades invaluables para comprender los efectos del tratamiento farmacológico antes del tratamiento clínico20. A pesar de esto, pocos grupos utilizan rutinariamente estos modelos proximales del paciente debido al acceso limitado al tejido primario fresco del paciente y la amplia optimización requerida para generar de manera reproducible condiciones de cultivo de organoides derivados del paciente (DOP). En un entorno in vivo, las células oncogénicas pueden interactuar y comunicarse con varias composiciones de los constituyentes circundantes, incluidas las células estromales, las células inmunes infiltrantes de tejido y la matriz12. Del mismo modo, para las DOP cultivadas en formato 3D, la complejidad celular / matriz se puede personalizar para incluir otros componentes relevantes. Los DOP se pueden generar rápidamente y, a menudo, se pueden pasar extensamente o criopreservar para su uso posterior, a pesar de tener una vida útil finita 21,22,23. La farmacodinámica (es decir, la respuesta a un fármaco) se puede evaluar mediante múltiples lecturas, incluida la viabilidad y morfología de los organoides, y la caracterización de objetivos inmunohistoquímicos o cambios transcripcionales.
Aquí, se describen los procedimientos para el establecimiento de organoides de cáncer de vejiga a partir de material de paciente recolectado de la resección transuretral del tumor de vejiga (TURBT) o la extirpación quirúrgica de la vejiga (cistectomía radical). El método para generar DOP está ilustrado, utilizando materiales y herramientas de laboratorio húmedos fácilmente disponibles. Los criterios de valoración incluyen cambios en las características morfológicas celulares y la viabilidad. Estos se midieron mediante microscopía de fluorescencia, ensayos de viabilidad in vitro (integridad metabólica y de la membrana celular) y análisis histopatológicos. La Figura 1 muestra el flujo de trabajo para establecer las PDO de cáncer de vejiga humana a partir del material clínico obtenido durante la cirugía electiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Si bien los protocolos organoides 3D derivados del tejido del cáncer de vejiga aún están en su infancia, son un área de investigación activa e investigación clínica. Aquí, se detalla un protocolo optimizado para establecer con éxito las PDO de cáncer de vejiga que son adecuadas para especímenes NMIBC y MIBC. Este flujo de trabajo se integra paralelamente en los ensayos clínicos hospitalarios y considera la acumulación de muestras de biobancos, incluido el procesamiento de muestras histológicas y los bancos …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos la asistencia técnica del núcleo de Histología del Instituto de Investigación Traslacional y la Instalación de Recursos Biológicos. Esta investigación fue apoyada por fondos de un premio de la Fundación de Investigación Princess Alexandra (I.V., E.D.W.), y el Programa de Traducción rápida de investigación aplicada del Fondo de Investigación Médica (MRFF) (Centro para el Análisis Personalizado de Cánceres (CPAC; E.D.W., I.V.). El Instituto de Investigación Traslacional recibe apoyo del Gobierno de Australia.
Materials
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
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