Summary
在这里，开发了基于小鼠和兔的动物模型，用于角膜上皮的机械和化学损伤，以筛选新的治疗方法和潜在机制。
Abstract
眼表角膜损伤，包括化学烧伤和创伤，可能导致严重的瘢痕形成、眼睑、角膜角膜缘干细胞缺乏，并导致大的、持续的角膜上皮缺损。伴有以下角膜混浊和外周新生血管的上皮缺损会导致不可逆的视力损害，并阻碍未来的治疗，尤其是角膜移植术。由于动物模型可以作为有效的药物开发平台，因此本文开发了小鼠角膜损伤和兔角膜上皮碱烧伤模型。新西兰白兔用于碱烧模型。在肌内和局部麻醉下，可以将不同浓度的氢氧化钠施加到角膜的中心圆形区域30秒。在大量等渗生理盐水冲洗后，残留的松散角膜上皮被去除，角膜毛刺深入到该圆形区域内的Bowman层。通过在钴蓝光下荧光素染色记录伤口愈合。C57BL / 6小鼠用于小鼠角膜上皮的创伤模型。使用直径为2mm的皮肤冲头标记小鼠中央角膜，然后在体视显微镜下用0.5mm毛刺的角膜锈环去除器进行清创。这些模型可用于前瞻性地验证滴眼液或混合药物（如干细胞）的治疗效果，这些药物可能促进角膜上皮再生。通过使用体视显微镜和成像软件观察角膜混浊、外周新生血管形成和结膜充血，可以监测这些动物模型中的治疗效果。
Introduction
人类角膜由五个主要层组成，在眼部屈光中起着关键作用，以保持视力和结构完整性，以保护眼内组织1。角膜的最外层是角膜上皮，由五到六层细胞组成，这些细胞依次与基底细胞分化并向上移动以从眼表脱落1。与人类和新西兰兔的角膜相比，小鼠角膜具有相似的角膜结构，但由于上皮和基质2的厚度减少，其外围比中央部分薄。由于其在眼科系统中的独特位置，许多外部损伤如机械损伤、细菌接种和化学制剂等可能容易危及上皮完整性，进而导致威胁视力的上皮缺损、感染性角膜炎、角膜融化，甚至角膜穿孔。
尽管润滑剂、抗生素、抗炎剂、自体血清产品和羊膜等各种治疗剂已被用于改善再上皮形成和减少疤痕形成，但其他可以实现伤口愈合、减少炎症和抑制疤痕形成的潜在治疗方式仍在不同的平台上开发和测试。已经提出了用于角膜上皮伤口愈合的各种动物模型，包括糖尿病小鼠3使用角膜锈环去除器去除角膜上皮，通过无菌25 G针头对小鼠角膜上皮进行线性划痕以进行细菌接种4，环钻辅助通过角膜锈环去除器去除角膜上皮5，超过一半角膜和角膜缘的上皮烧灼6，环钻通过钝的手术刀刀片7擦伤兔角膜，以及通过液氮8快速冷冻对牛角膜损伤。
除了对角膜上皮的机械损伤外，化学制剂也是对眼表的常见侮辱，尤其是酸性和碱性物质。氢氧化钠（NaOH，0.1-1 N，持续30-60秒）是角膜化学烧伤9，10，11，12，13的小鼠和兔模型中常用的化学物质之一。在大鼠化学烧伤模型中，还将100%乙醇施用于角膜，然后使用手术刀片14进行额外的机械刮擦。由于维持健康的眼表依赖于功能单位，包括眼睑、睑板腺、泪系统、结膜和角膜，因此体内动物模型比离体培养的角膜上皮细胞或角膜组织具有一些优点。本文演示了角膜擦伤创面的小鼠模型和角膜碱烧伤的兔模型。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
动物研究中的所有实验程序均已获得长庚纪念医院研究伦理委员会的批准，并遵守ARVO关于将动物用于眼科和视觉研究的声明。
1.小鼠角膜上皮离 体 伤口愈合模型
- 小鼠的制备
- 通过腹膜内递送盐酸氯胺酮（80-100mg / kg体重）和甲苯噻嗪（5-10mg / kg体重）对C57BL / 6小鼠进行全身麻醉。
- 通过确认小鼠对有害刺激的运动丧失和矫正反射的丧失，确保全身麻醉起作用。
- 用手固定小鼠头部，并用一滴0.5%盐酸丙帕卡因眼用溶液对双眼进行局部麻醉（图1A）。用5%甜菜碱消毒眼表和眼睑三次。
- 小鼠角膜上皮伤口模型的创建
注意：在体视显微镜下执行以下步骤。角膜伤口是在 体内而不是 体外创建的，以更好地操纵眼球并接近现实世界的情况。这是一个终端程序;因此，只需要清洁的器械（不是无菌技术）。- 使用皮肤活检打孔器（直径2毫米）标记小鼠的中央角膜，以确认伤口的边界清晰且可测量的区域。
- 轻轻地将冲头压在中央角膜上以留下圆形标记（图1B）。使用带有0.5毫米毛刺的手持式角膜除锈环器，将角膜上皮清创至Bowman层，确保不会损坏后者（图1C）。用角膜钳去除伤口边缘内部残留的松散组织。
- 用荧光素染色确认清创区域（图1D）。要进行荧光素染色，将一滴生理盐水滴在荧光素纸上以溶解荧光素，然后将含荧光素的滴剂滴到小鼠上皮缺损上，以便在钴蓝光下观察。
- 小鼠角膜擦伤伤口模型的离体培养。
- 要收获小鼠眼球，请按以下步骤进行。
- 在诱导室中用5%异氟醚诱导麻醉后，通过颈椎脱位处死小鼠。通过确认小鼠对有害刺激的运动丧失和矫正反射的丧失，确保麻醉起作用。
- 用镊子的尖端轻轻按压上和下眶边缘，将眼球推出。将闭合的角膜剪刀的尖端沿下眶壁引入延髓后间隙，确保不穿透眼球。
- 用0.3毫米角膜钳固定眼球，然后用角膜剪刀切断视神经和眶周软组织，隔离眼球。
- 对于小鼠眼球的 离体 培养，请按以下步骤进行。
- 在孔内准备一个带有熔蜡的 48 孔板，等待凝固。用结膜镊子的尖端，在固化蜡的表面上创建一个圆孔，以容纳眼球。
- 将收获的眼球直接放在48孔板上（图1E），底部和侧壁覆盖蜡以建立稳定性（图1F）。
- 根据研究目的，用含有1%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）在5%CO2 的潮湿气氛中培养眼球，有或没有抗生素。
注意：如果该模型用于研究角膜上皮伤口愈合，则需要抗生素来预防感染。但是，如果该模型用于评估抗生素或混合药物的疗效，则不需要预防性抗生素。 - 用培养基浸入眼表，不要使眼球漂浮。
- 通过荧光素染色（步骤1.2.3）记录伤口愈合过程，并在钴蓝光下用数码相机收集照片。
注意：在机械性角膜损伤小鼠模型的前瞻性实验中，接受角膜擦伤并进一步测试治疗剂疗效的小鼠被视为实验组，而接受角膜擦伤而不进行进一步治疗的小鼠被视为阴性对照组。
2 .角 膜碱损伤的体内兔模型
注意：在该模型中，诱导碱烧伤，然后对角膜上皮进行机械清创，以产生明确且均匀的伤口区域，以供后续定量。使用前对所有器械进行消毒。
- 准备具有术前镇痛的兔子，包括肌内注射全身镇痛药和局部滴眼液。
- 通过肌肉注射盐酸氯胺酮（35-44mg / kg体重），在后腿与甲苯噻嗪（5-10mg / kg体重）混合，对新西兰大白兔进行全身麻醉。
- 定位兔子并用毛巾覆盖后，在体视显微镜下滴0.5%盐酸丙帕卡因眼用溶液（图2A）在右眼上应用局部麻醉。用5%甜菜碱消毒眼表和眼睑三次。
- 诱发角膜碱烧伤
- 将直径为8毫米的圆形滤纸（使用8毫米冲头切割）放入培养皿中。使用滴管将0.5N氢氧化钠（NaOH）加入培养皿中以浸泡滤纸。从滤纸中排出多余的NaOH溶液，然后再将它们放在兔角膜上。
注意：0.5 N NaOH可能会对人体组织造成严重的侵蚀性损伤。处理时戴手套。如果皮肤或眼睛接触到NaOH液滴，则需要用大量的生理盐水和医疗帮助冲洗，以减少进一步的损害。 - 用眼睑窥器打开眼睑并确认兔膜不干扰滤纸的插入（图2B）后，将浸泡在0.5N NaOH中的圆形滤纸放在中央角膜上30秒，然后用镊子将其取出（图2C）。
- 取出滤纸后，用10mL生理盐水冲洗眼表，洗掉碱性物质。
- 将直径为8毫米的圆形滤纸（使用8毫米冲头切割）放入培养皿中。使用滴管将0.5N氢氧化钠（NaOH）加入培养皿中以浸泡滤纸。从滤纸中排出多余的NaOH溶液，然后再将它们放在兔角膜上。
- 完成性角膜上皮缺损
- 使用带有0.5毫米毛刺的角膜锈环去除器将混浊区域内的角膜上皮清创至Bowman膜（图2D）。
- 在钴蓝光下用荧光素染色确认清创区域，并使用角膜钳去除残留的角膜上皮（图2E）。
- 通过睑裂确保伤口状况
- 确认鼻膜平滑覆盖鼻侧的眼表和角膜上皮缺损。确保膜不会折叠或扭曲太多，以免干扰伤口愈合过程和实验。
- 使用6-0缝合线进行有或没有局部药物的临时跗骨切除术，以保护眼表并防止兔子抓伤它（图2F）。确保睑裂缝合线距上下睑边缘3-4毫米，有4-5个系带和更长的结，以防止兔子折断缝合线。
注意：如果实验不涉及抗生素研究，则可以考虑使用抗生素外用药物。 - 在该兔模型中，接受碱烧伤和角膜上皮切除的患者被视为对照组。
注意：在前瞻性实验中，接受碱烧角膜损伤并用治疗剂进一步治疗的兔子被视为实验组。仅接受碱烧伤治疗的兔子，不进行进一步治疗，被视为阴性对照组。
- 术后镇痛和疼痛控制
- 通过监测动物的疼痛和痛苦，评估手术后 7 天的生理状况和 USDA 疼痛水平。根据评估结果考虑使用妥布霉素软膏和一滴0.5%盐酸丙帕卡因眼用溶液。每 6-8 小时给予盐酸丁丙诺啡 （0.03 mg/kg），持续 3 天。
注意：对于缺陷区域的日常测量和手术后的观察，该程序属于美国农业部D类。
- 通过监测动物的疼痛和痛苦，评估手术后 7 天的生理状况和 USDA 疼痛水平。根据评估结果考虑使用妥布霉素软膏和一滴0.5%盐酸丙帕卡因眼用溶液。每 6-8 小时给予盐酸丁丙诺啡 （0.03 mg/kg），持续 3 天。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
小鼠角膜上皮离体伤口愈合模型：
使用手持式角膜锈环去除剂对小鼠角膜上皮进行体内清创后，在中央2mm区域可以发现具有阳性荧光素染色的轻度凹陷中央角膜区域（图3A-B）。收获小鼠眼球后，将其轻松固定在涂有蜡的48孔培养板上，无需显着旋转。按照该方案，可以在体视显微镜下的48孔培养板内每天检查和记录小鼠眼球的离体培养（图3C）。清创小鼠角膜上皮一天后，在钴蓝光下获得的数码照片中可以显示一个直径为2毫米的圆形荧光素染色上皮缺损（图3D）。初始不规则染色的伤口边缘或荧光素染色阴性意味着角膜上皮去除不完全或失败。在伤口愈合的正常过程中，角膜上皮缺损将在2-3天内愈合，荧光素染色区域减少。
角膜碱损伤的体内兔模型：
在任何手术之前，完整的兔角膜上皮不能用荧光素染色。在对兔角膜上皮造成碱损伤后，可以在中央角膜上观察到有或没有钴蓝光的阳性荧光素染色，具有清晰而完整的圆形边缘（图 4A-B 和图 5B）。未填充区域的不完全染色代表残留角膜上皮组织或染色失败。在定期随访期间，角膜上皮伤口重新上皮化，痣从角膜缘向内生长，随后染色面积减少（图5C）。上皮缺损在3-4周内愈合。如果突然出现角膜溃疡、脱膜、大面积上皮缺损或大量白色或黏液分泌物，应考虑不安全的睑裂、缝合线暴露、错位的眼膜或睑结膜内异物。
图1：建立角膜机械损伤小鼠模型的程序 。 （A）手术前进行局部麻醉。（B）用2毫米皮肤活检环钻在中央角膜上进行温和的压痕。（C）角膜除锈环用于去除中央角膜上皮。（D）用荧光素对上皮缺损进行染色，以确认缺损区域，并将其与 B中标记的区域进行比较。（中、女）收获小鼠眼球并事先转移到覆盖有蜡的48孔板上。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：建立碱性角膜损伤兔模型的步骤 。 （A）局部麻醉应用于眼表。（B）使用眼睑窥器打开上下眼睑，而不折叠或挤压眼睑膜。（C）将NaOH浸泡的环钻滤纸（直径8毫米）放在中央角膜上。（D）角膜除锈环器用于将8毫米中央上皮清创至Bowman层。（E）上皮缺损用荧光素染色。（F）手术后，进行跗骨切除术以保护伤口免受划伤。 请点击此处查看此图的大图。
图3：角膜机械损伤小鼠模型中的阳性和阴性结果。 （A）完整的小鼠角膜上皮，在手术前没有任何染色。（B）在小鼠角膜伤口上用荧光素进行体内阳性染色，无钴蓝光。（C）小鼠眼球离体培养，在加入培养基前不添加荧光素染色剂。（D）离体小鼠模型中荧光素对角膜上皮缺损的阳性染色。2毫米的上皮缺损通常在2-3天内愈合。请点击此处查看此图的大图。
图 4：角膜碱损伤兔模型中 荧光素染色的结果。 （A）钴蓝光下的阳性荧光素染色。这张照片是在机械性角膜损伤后拍摄的。（B）在没有钴蓝光的兔子眼表上也可以观察到荧光素染料的阳性染色。（C）愈合的眼表呈阴性染色。 请点击此处查看此图的大图。
图5：角膜碱损伤兔模型中伤口愈合的时间过程和再上皮化的外观 。 （A）小鼠和兔模型中的再上皮化分别需要2-3天和3-4周。（B）兔模型中碱烧伤后用荧光素染色的8毫米上皮缺损。钴蓝光用作光源。这张照片是在碱损伤后拍摄的。（C）碱损伤3周后兔眼上皮缺损愈合，染色面积缩小。 请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
角膜损伤的小鼠和兔模型为监测伤口愈合、测试新疗法以及研究伤口愈合和治疗途径的潜在机制提供了一个有用的 离体 和 体内 平台。根据研究目的，不同的动物模型可用于短期或长期实验。例如，在 体内小鼠角膜上产生上皮缺陷后，局限性上皮缺陷可用于监测少量液体治疗剂。同时，周围的功能单位，如眼睑、泪系统和结膜，可以在体内 条件下进行评估，而不是细胞培养或 离体 培养条件。在这种情况下，如果小鼠运动可能影响实验条件，则可能仍需要跗骨。观察和量化圆形伤口比简单的线性划痕伤口更容易观察和量化4.然而，在角膜上形成分界线的皮肤冲头应该小心地进行，不要切开Bowman的膜，否则会留下深角膜损伤或穿透性伤口。机械角膜伤口也可以由兔型15中的8毫米角膜环钻和手术刀刀片形成，其中更深的伤口向下到前基质而不是角膜上皮。
角膜锈环去除是另一个值得一提的关键问题。由于小鼠眼球很小，角膜上皮的过度去除或去除不足可能会受到影响研究的准确性。用皮肤活检打孔和荧光素引导的手术标记角膜将有助于减少这些错误。尽管在动物模型6，7中，烧灼和手术刀刀片已被提出作为去除角膜上皮的工具，但眼表的损伤可能不容易以相同的方式控制和复制，这可能导致进一步实验的结果不一致。
与体内条件相比，48孔板中的离体培养小鼠眼球由于平板上的工作空间更大，因此更易于操作，并且可用于同时测试各种培养基中的复杂试剂，例如药物洗脱隐形眼镜和细胞疗法。当收集小鼠眼球并将其转移到48孔板上时，对角膜的细致保护对于避免对眼表的额外人为损伤和眼球破裂非常重要。对于下面的研究，眼球可以固定在石蜡涂层的孔内，角膜朝上并浸入培养基中。眼球漂浮或旋转或角膜脱水会阻碍结果。由于这种离体小鼠模型侧重于眼表的变化，因此在此离体模型中不讨论其他功能单位，例如泪腺和眼睑。与体内动物模型相比，离体小鼠模型还降低了繁殖和饲养小鼠的成本，并节省了实验空间。该模型适用于短期研究，而不是长期研究，因为从长远来看可能会发生潜在的组织感染和器官衰竭。
尽管小鼠模型成本较低并且可以在实验室中放大，但较小的表面积可能会限制通过体视显微镜观察角膜的详细变化，例如脂质沉积和新生血管形成。相反，眼球直径较大的角膜损伤兔模型通常可以弥补这一缺点。通过调节NaOH的浓度和浸泡时间，可以产生不同程度的角膜碱烧伤严重程度。在大鼠化学烧伤模型中，使用1 N NaOH用3 mm滤纸浸泡角膜40 s，用4 mm滤纸浸泡角膜20 s，为观察提供相似但较小的区域16，17。为了保持碱烧的大小和浓度一致，建议在制备 8 毫米滤纸时使用全新的锋利冲头，以避免纸张边缘有任何纤维或未填充的角落。需要充分冲洗以洗去眼表和结膜囊中的化学试剂，以减少伤口外的持续损伤。由于兔膜在被碱剂腐蚀时可能会干扰实验过程并引起疼痛，因此必须小心保护并在手术后将其放回生理位置，以减少眼表的额外炎症。在碱烧伤手术后，兔角膜伤口可以用跗骨或其他材料（如隐形眼镜）保护，以确保实验的质量和一致性。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
该研究由台湾原子能委员会（批准号A-IE-01-03-02-02），科学技术部（批准号NMRPG3E6202-3）和长庚医学研究项目（批准号CMRPG3H1281）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6/0 Ethicon vicryl suture | Ethicon | 6/0VICRYL | tarsorrhaphy |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | mouse strain |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 61763-23-3 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
| New Zealand White Rabbits | Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan | Rabbit models | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Proparacaine | Alcon | ALC2UD09 | topical anesthetics |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Sodium chloride (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1310-73-2 | a chemical agent for alkali burn |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 | |
| Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL | Elanco animal health Korea Co., LTD. | 047-956 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
References
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
- Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. G. Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3648-3654 (2009).
- Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
- Ma, X., et al. Corneal epithelial injury-induced norepinephrine promotes Pseudomonas aeruginosa keratitis. Experimental Eye Research. 195, 108048 (2020).
- Chan, M. F., Werb, Z.
- Lan, Y., et al. Kinetics and function of mesenchymal stem cells in corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3638-3644 (2012).
- Watanabe, M., et al. Promotion of corneal epithelial wound healing in vitro and in vivo by annexin A5. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1862-1868 (2006).
- Murataeva, N., et al. Cannabinoid CB2R receptors are upregulated with corneal injury and regulate the course of corneal wound healing. Experimental Eye Research. 182, 74-84 (2019).
- Carter, K., et al. Characterizing the impact of 2D and 3D culture conditions on the therapeutic effects of human mesenchymal stem cell secretome on corneal wound healing in vitro and ex vivo. Acta Biomaterialia. 99, 247-257 (2019).
- Sanie-Jahromi, F., et al. Propagation of limbal stem cells on polycaprolactone and polycaprolactone/gelatin fibrous scaffolds and transplantation in animal model. Bioimpacts. 10 (1), 45-54 (2020).
- Sun, M. M., et al. Epithelial membrane protein (EMP2) antibody blockade reduces corneal neovascularization in an In vivo model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (1), 245-254 (2019).
- Yang, Y., et al. Cannabinoid receptor 1 suppresses transient receptor potential vanilloid 1-induced inflammatory responses to corneal injury. Cell Signal. 25 (2), 501-511 (2013).
- Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Oh, J. Y., et al. Anti-inflammatory protein TSG-6 reduces inflammatory damage to the cornea following chemical and mechanical injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16875 (2010).
- Wang, T., et al. Evaluation of the effects of biohcly in an in vivo model of mechanical wounds in the rabbit cornea. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 35 (3), 189-199 (2019).
- Gong, Y., et al. Effect of nintedanib thermos-sensitive hydrogel on neovascularization in alkali burn rat model. International Journal of Ophthalmology. 13 (6), 879-885 (2020).
- Yao, L., et al. Role of mesenchymal stem cells on cornea wound healing induced by alkali burn. PLoS One. 7 (2), 30842 (2012).
