הדמיה וכימות של תרכובות פרמצבטיות בתוך העור באמצעות הדמיית פיזור ראמן קוהרנטית
Summary
מתוארת מתודולוגיית הדמיית פיזור ראמאן קוהרנטית להדמיה וכימות של תרכובות תרופתיות בתוך העור. מאמר זה מתאר הכנת רקמות עור (אדם ועכבר) ויישום פורמולציה מקומית, רכישת תמונה לכימות פרופילי ריכוז מרחביים-טמפורליים, וניתוח פרמקוקינטי ראשוני להערכת אספקת תרופות מקומית.
Abstract
פרמקוקינטיקה עורית (cPK) לאחר יישום פורמולציה מקומית הייתה תחום מחקר שמעניין במיוחד מדעני רגולציה ופיתוח תרופות כדי להבין באופן מכניסטי את הזמינות הביולוגית המקומית (BA). טכניקות פולשניות למחצה, כגון הפשטת סרט, מיקרודיאליזה עורית או מיקרופרפוזיה של זרימה פתוחה עורית, מכמתות כולן cPK בקנה מידה מאקרו. בעוד שטכניקות אלה סיפקו ידע עצום ב-cPK, הקהילה חסרה הבנה מכניסטית של חדירה וחדירה של חומרים פרמצבטיים פעילים (API) ברמה התאית.
גישה לא פולשנית אחת לטיפול ב-cPK בקנה מידה זעיר היא הדמיית פיזור ראמאן (CRI) קוהרנטית, המכוונת באופן סלקטיבי לתנודות מולקולריות פנימיות ללא צורך בתוויות חיצוניות או בשינוי כימי. ל-CRI יש שתי שיטות עיקריות – פיזור ראמאן אנטי-סטוקסי קוהרנטי (CARS) ופיזור ראמאן מגורה (SRS) – המאפשרות כימות רגיש וסלקטיבי של ממשקי API או רכיבים לא פעילים. CARS משמש בדרך כלל להפקת מידע מבני על העור או להדמיית ניגודיות כימית. לעומת זאת, אות ה-SRS, שהוא ליניארי עם ריכוז מולקולרי, משמש לכימות ממשקי API או מרכיבים לא פעילים בתוך ריבוד העור.
למרות שרקמת עכבר משמשת בדרך כלל ל-cPK עם CRI, יש להעריך בסופו של דבר BA מקומי וביו-אקוויוולנטיות (BE) ברקמה אנושית לפני אישור רגולטורי. מאמר זה מציג מתודולוגיה להכנה ותמונה של עור ex vivo לשימוש במחקרי CRI פרמקוקינטיים כמותיים בהערכת תואר ראשון ו- BE מקומיים. מתודולוגיה זו מאפשרת כימות API אמין וניתן לשחזור בתוך עור האדם והעכבר לאורך זמן. הריכוזים בתוך תאים עשירים בשומנים ועניים בשומנים, כמו גם ריכוז ה-API הכולל לאורך זמן מכמתים; אלה משמשים לאומדנים של BA בקנה מידה זעיר ומאקרו, וייתכן שגם BE.
Introduction
מתודולוגיות להערכת cPK לאחר יישום מוצר תרופתי מקומי התרחבו ממחקרים קלאסיים של בדיקות חדירה במבחנה (IVPT) 1,2,3,4,4,5 והפשטת קלטת 6,7,8 למתודולוגיות נוספות כגון מיקרופרפוזיה בזרימה פתוחה או מיקרודיאליזה עורית 9,10,11, 12,13,14. ישנם אתרים מקומיים שונים של פעולה טיפולית בהתאם למחלה המעניינת. לפיכך, ייתכן שיש מספר מתאים של מתודולוגיות כדי להעריך את הקצב והמידה שבהם API מגיע לאתר הפעולה המקומי המיועד. בעוד שלכל אחת מהמתודולוגיות הנ”ל יש יתרונות, החיסרון העיקרי הוא היעדר מידע cPK בקנה מידה זעיר (כלומר, חוסר היכולת לדמיין לאן ה- API הולך וכיצד הוא מחלחל).
מתודולוגיה לא פולשנית אחת המעניינת להערכת BA ו- BE אקטואליים היא CRI, אותה ניתן לפרק לשני אופני הדמיה: CARS ומיקרוסקופיה SRS. שיטות ראמאן קוהרנטיות אלה מאפשרות הדמיה ספציפית מבחינה כימית של מולקולות באמצעות אפקטים לא ליניאריים של ראמאן. ב-CRI, שתי רכבות פולס לייזר ממוקדות ונסרקות בתוך דגימה; ההבדל באנרגיה בין תדרי הלייזר מוגדר כך שיתמקד במצבי רטט ספציפיים למבנים הכימיים המעניינים. מכיוון שתהליכי CRI אינם ליניאריים, אות נוצר רק במוקד המיקרוסקופ, מה שמאפשר הדמיה טומוגרפית פרמקוקינטית תלת-ממדית של הרקמה. בהקשר של cPK, CARS שימשה לקבלת מידע מבני של רקמות, כגון המיקום של מבני עור עשירים בשומנים15. לעומת זאת, נעשה שימוש ב-SRS כדי לכמת את הריכוז המולקולרי מכיוון שהאות שלו ליניארי עם ריכוז. עבור דגימות עור ex vivo , זה יתרון לבצע CARS בכיוון epi16 ו- SRS במצב תיבת הילוכים17. לכן, דגימות רקמה דקות יאפשרו זיהוי וכימות אותות SRS.
כרקמה לדוגמה, אוזן העכבר העירומה מציגה מספר יתרונות עם חסרונות קלים. יתרון אחד הוא שהעובי של הרקמה כבר כ-200-300 מיקרומטר ואינו דורש הכנת דגימה נוספת. בנוסף, מספר ריבודי עור נראים על ידי התמקדות אקסיאלית דרך שדה ראייה אחד (למשל, שכבת קרנית, בלוטות חלב (SGs), אדיפוציטים ושומן תת עורי)16,18. זה מאפשר הערכה פרה-קלינית ראשונית של מסלולי חדירה עוריים והערכות BA מקומיות לפני המעבר לדגימות עור אנושיות. עם זאת, מודל העכבר העירום מציג מגבלות כגון קושי באקסטרפולציה לתרחישי in vivo עקב הבדלים במבנה העור19. בעוד שאוזן העכבר העירום היא מודל מצוין להשגת תוצאות ראשוניות, מודל העור האנושי הוא תקן הזהב. למרות שהיו פרשנויות שונות על ההתאמה והישימות של עור אנושי קפוא כדי לשחזר במדויק קינטיקה של חדירה in vivo 20,21,22, השימוש בעור אדם קפוא הוא שיטה מקובלת להערכת קינטיקה של חדירת API במבחנה 23,24,25 . פרוטוקול זה מדמיין שכבות עור שונות בעור העכברים ובני האדם תוך כימות ריכוזי ה-API בתוך מבנים עשירים בשומנים ועניים בשומנים.
בעוד ש-CRI שימשה בתחומים רבים כדי להמחיש באופן ספציפי תרכובות בתוך רקמות, היו מאמצים מוגבלים לחקור את ה-cPK של מוצרי תרופות המיושמים באופן מקומי. כדי להעריך את ה- BA/ BE האקטואלי של מוצרים מקומיים באמצעות CRI, יש צורך תחילה בפרוטוקול סטנדרטי כדי לבצע השוואות מדויקות. מאמצים קודמים שהשתמשו ב-CRI לצורך אספקת תרופות לעור הוכיחו שונות בתוך הנתונים. מכיוון שמדובר ביישום חדש יחסית של CRI, הקמת פרוטוקול היא קריטית כדי להשיג תוצאות אמינות 18,26,27. גישה זו מכוונת רק למספר גל ספציפי אחד באזור השקט הביולוגי של ספקטרום הראמן. עם זאת, לרוב ממשקי ה-API והמרכיבים הלא פעילים יש תזוזות Raman בתוך אזור טביעת האצבע. זה הציב בעבר אתגרים בשל האות האינהרנטי הנובע מהרקמה באזור טביעת האצבע. ההתקדמות האחרונה בלייזר ובחישוב הסירה את המחסום הזה, שניתן להשתמש בו גם בשילוב עם הגישה המוצגת כאן28. גישה זו המוצגת כאן מאפשרת כימות של API, בעל תזוזת ראמאן באזור השקט (2,000-2,300 ס”מ-1). זה לא מוגבל לתכונות הפיזיוכימיות של התרופה, מה שעשוי להיות המקרה עבור כמה מתודולוגיות ניטור cPK שהוזכרו קודם לכן29.
הפרוטוקול חייב להפחית את השונות בין דגימה לדגימה בעובי העור לצורך תכשירים שונים, שכן דגימות עור אנושיות עבות יפיקו אות מינימלי לאחר יישום מוצר התרופה עקב פיזור קל על ידי הדגימה העבה. מטרתו של כתב יד זה היא להציג מתודולוגיה להכנת רקמות המבטיחה תקני הדמיה הניתנים לשחזור. בנוסף, מערכת CRI מוגדרת כמתואר כדי להפחית מקורות שגיאה פוטנציאליים, כמו גם למזער אות לרעש. עם זאת, מאמר זה לא ידון בעקרונות המנחים וביתרונות הטכניים של מיקרוסקופ CRI שכן זה כוסה בעבר30. לבסוף, הליך ניתוח הנתונים המקיף נבחן כדי לאפשר פרשנות של התוצאות כדי לקבוע את הצלחת הניסוי או כישלונו.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההערכה של BA/BE אקטואלי היא תחום מחקר הדורש גישה רבת פנים מכיוון שאף שיטה אחת לא יכולה לאפיין באופן מלא את in vivo cPK. פרוטוקול זה מציג מתודולוגיה להערכת BA/BE של מוצר תרופתי מקומי המבוסס על הדמיית ראמאן קוהרנטית. אחת הנקודות הראשונות שניתן להתעלם מהן היא עד כמה דקות דגימות העור חייבות להיות, ב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לד”ר פוטיס איליופולוס ולדניאל גרינפילד מקבוצת אוונס על הדיון וההגהה של כתב יד זה. בנוסף, המחברים רוצים להודות על התמיכה של LEO Pharma. איור 2 נוצר עם BioRender.com.
Materials
| Tissue Preparation | |||
| Autoclavable Biohazard Bags | FisherBrand | 22-044562 | As refered to in text: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562 |
| Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Corning | MT21030CV | As refered to in text: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv |
| Disposable Scalpels | Exel International | 14-840-00 | As refered to in text: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true |
| High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-132 | As refered to in text: forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword= |
| Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science | 06-666 | As refered to in text: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666 |
| Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Bemis | 13-374-12 | As refered to in text: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412 |
| Petri Dish (35 mm x 10 mm) | Fisherbrand | FB0875711YZ | As refered to in text: small petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true |
| Petri Dish (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB0875713A | As refered to in text: large petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true |
| Surgical Scissors | Roboz | NC9411473 | As refered to in text: scissors https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC |
| Laser/microscope | |||
| 650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | As refered to in text: CARS filter – CH2 vibrations (645nm/60nm filter) | |
| Control box IX2-UCB | Olympus | As refered to in text: Control Box | |
| D700/30m | Chroma | As refered to in text: CARS filter – deuterated band https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m |
|
| DeepSee Insight | Spectra-Physics | As refered to in text: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser |
|
| Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console | ThorLabs | PM100D | As refered to in text: power meter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Fluoview Software | Olympus | As refered to in text: Microscope Control software | |
| Frosted Microscope Slides | FisherBrand | As refered to in text: microscope slides https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446 |
|
| FV1000 | Olympus | As refered to in text: Microscope | |
| Incubation Chamber | Tokai Hit | GM-800 | As refered to in text: incubation chamber |
| Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S142C | As refered to in text: photodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Power supply FV31-PSU | Olympus | As refered to in text: Power Supply | |
| Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator | BK Precision | As refered to in text: function generator | |
| ProScan – Precision Microscope Automation | Prior Scientific Instruments | As refered to in text: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation |
|
| SecureSeal Imaging Spacers | Grace Biolabs | 654004 | As refered to in text: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/ |
| SRS Detection Kit | APE | As refered to in text: SRS detector | |
| UPLSAPO 20X NA:0.75 | Olympus | As refered to in text: 20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/ |
|
| Lipid/Drug Imaging | |||
| 35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter | MatTek Corporation | NC9711297 | As refered to in text: Glass bottom dish https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297 |
| Cotton-tipped applicators | FisherBrand | As refered to in text: Cotton-tipped applicator | |
| Distriman Postive Displacement Pipette | Gilson | As refered to in text: Postive Displacement Pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword= |
|
| Distriman Postive Displacement Pipette Tips | Gilson | As refered to in text: Tips for pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true |
|
| Data Analysis | |||
| FIJI | Open-source | As refered to in text: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ |
|
| Jupyter-Lab | open-source | As refered to in text: JupyterLab https://jupyter.org/ |
|
| Rstudio | Open-source | As refered to in text: Rstudio https://www.rstudio.com/ |
References
- Finnin, B., Walters, K. A., Franz, T. J., Benson, H. E., Watkinson, A. C. In vitro skin permeation methodology. In Transdermal and topical drug delivery: principles and methodology. Transdermal and topical drug delivery: principles and practice. , 85-108 (2012).
- Shin, S. H., et al. On the road to development of an in vitro permeation test (IVPT) model to compare heat effects on transdermal delivery systems: exploratory studies with nicotine and fentanyl. Pharmaceutical Research. 34 (9), 1817-1830 (2017).
- Hossain, A., et al. Preparation, characterisation, and topical delivery of terbinafine. Pharmaceutics. 11 (10), 548 (2019).
- Santos, L. L., Swofford, N. J., Santiago, B. G. In vitro permeation test (IVPT) for pharmacokinetic assessment of topical dermatological formulations. Current Protocols in Pharmacology. 91 (1), 79 (2020).
- Iliopoulos, F., Caspers, P. J., Puppels, G. J., Lane, M. E. Franz cell diffusion testing andquantitative confocal Raman spectroscopy: In vitro-in vivo correlation. Pharmaceutics. 12 (9), 887 (2020).
- Cordery, S., et al. Topical bioavailability of diclofenac from locally-acting, dermatological formulations. International Journal of Pharmaceutics. 529 (1-2), 55-64 (2017).
- Pensado, A., et al. Stratum corneum sampling to assess bioequivalence between topicalacyclovir products. Pharmaceutical Research. 36 (12), 1-16 (2019).
- Zhang, Y., et al. Dermal delivery of niacinamide-in vivo studies. Pharmaceutics. 13 (5), 726 (2021).
- Bodenlenz, M., et al. Open flow microperfusion as a dermal pharmacokinetic approach to evaluate topical bioequivalence. Clinical Pharmacokinetics. 56 (1), 91-98 (2017).
- Eirefelt, S., et al. Evaluating dermal pharmacokinetics and pharmacodymanic effect of soft topical PDE4 inhibitors:Open flow microperfusion and skin biopsies. Pharmaceutical Research. 37 (12), 1-12 (2020).
- Stagni, G., O’Donnell, D., Liu, Y. J., Kellogg, J. D. L., Shepherd, A. M. Iontophoretic current and intradermal microdialysis recovery in humans. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 49-54 (1999).
- Garcia Ortiz, P., Hansen, S. H., Shah, V. P., Menne, T., Benfeldt, E. Impact of adultatopic dermatitis on topical drug penetration: assessment by cutaneous microdialysis and tape stripping. Acta Dermato-Venereologica. 89 (1), 33-38 (2009).
- Joshi, A., Patel, H., Joshi, A., Stagni, G. Pharmacokinetic applications of cutaneous microdialysis: Continuous+intermittent vs continuous-only sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 83, 16-20 (2017).
- Kuzma, B. A., et al. Evaluation of local bioavailability of metronidazole from topical formulations using dermal microdialysis: Preliminary study in a Yucatan mini-pig model. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 159, 105741 (2021).
- Begley, R., Harvey, A., Byer, R. L.Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy. Applied Physics Letters. 25 (7), 387-390 (1974).
- Evans, C. L., et al. Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807-16812 (2005).
- Hill, A. H., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
- Feizpour, A., Marstrand, T., Bastholm, L., Eirefelt, S., Evans, C. L. Label-free quantification of pharmacokinetics in skin with stimulated Raman scattering microscopy and deep learning. Journal of Investigative Dermatology. 141 (2), 395-403 (2021).
- Ghosh, B., Reddy, L. H., Kulkarni, R. V., Khanam, J. Comparison of skin permeability of drugs in mice and human cadaver skin. Indian Journal of Experimental Biology. 38 (1), 42-45 (2000).
- Nielsen, J. B., Plasencia, I., Sørensen, J. A., Bagatolli, L. Storage conditions of skin affect tissue structure and subsequent in vitro percutaneous penetration. Skin Pharmacology and Physiology. 24 (2), 93-102 (2011).
- Barbero, A. M., Frasch, H. F. Effect of frozen human epidermis storage duration and cryoprotectant on barrier function using two model compounds. Skin Pharmacology and Physiology. 29 (1), 31-40 (2016).
- Babu, R., et al. The influence of various methods of cold storage of skin on the permeation of melatonin and nimesulide. Journal of Controlled Release. 86 (1), 49-57 (2003).
- Skelly, J. P., et al. FDA and AAPS report of the workshop on principles and practices of in vitro percutaneous penetration studies: relevance to bioavailability and bioequivalence. Pharmaceutical Research. 4 (3), 265-267 (1987).
- OECD. Guidance document for the conduct of skin absorption studies. OECD. , (2004).
- OECD. Test no. 428: Skin absorption: In vitro method. OECD. , (2004).
- Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging drug delivery to skin with stimulated Raman scattering microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-windowsparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
- Herkenne, C., et al. In vivo methods for the assessment of topical drug bioavailability. Pharmaceutical Research. 25 (1), 87-103 (2008).
- Alfonso-Garcıa, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Osseiran, S., et al. Longitudinal monitoring of cancer cell subpopulations in monolayers, 3D spheroids, and xenografts using the photoconvertible dye DiR. Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).
- Evennett, P. Kohler illumination: a simple interpretation. Proceedings of the Royal Microscopical Society. 28 (4), 189-192 (1983).
- Sanderson, J. Fundamentals of microscopy. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (2), 76 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hunter, J. D. Matplotlib: A 2D graphics environment. Computing in Science & Engineering. 9 (3), 90-95 (2007).
- Wickham, H. . ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , (2016).
- Kim, H., Han, S., Cho, Y. S., Yoon, S. K., Bae, K. Development of R packages:’Non-Compart’ and ‘ncar’ for noncompartmental analysis (NCA). Translational and Clinical Pharmacology. 26 (1), 10-15 (2018).
