Visualiseren en kwantificeren van farmaceutische verbindingen in de huid met behulp van Coherent Raman Scattering Imaging
Summary
Een coherente Raman scattering imaging methodologie om farmaceutische verbindingen in de huid te visualiseren en te kwantificeren wordt beschreven. Dit artikel beschrijft huidweefselpreparaat (mens en muis) en topische formuleringstoepassing, beeldacquisitie om spatiotemporale concentratieprofielen te kwantificeren en voorlopige farmacokinetische analyse om de toediening van topische geneesmiddelen te beoordelen.
Abstract
Cutane farmacokinetiek (cPK) na topische formuleringstoepassing is een onderzoeksgebied van bijzonder belang geweest voor wetenschappers op het gebied van regelgeving en geneesmiddelenontwikkeling om de actuele biologische beschikbaarheid (BA) mechanistisch te begrijpen. Semi-invasieve technieken, zoals tape-stripping, dermale microdialyse of dermale open-flow microperfusie, kwantificeren allemaal macroschaal cPK. Hoewel deze technieken enorme cPK-kennis hebben opgeleverd, mist de gemeenschap een mechanistisch begrip van de penetratie en permeatie van actieve farmaceutische ingrediënten (API) op cellulair niveau.
Een niet-invasieve benadering om cPK op microschaal aan te pakken, is coherente Raman-verstrooiingsbeeldvorming (CRI), die selectief intrinsieke moleculaire trillingen target zonder de noodzaak van extrinsieke labels of chemische modificatie. CRI heeft twee hoofdmethoden – coherente anti-Stokes Raman-verstrooiing (CARS) en gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS) – die gevoelige en selectieve kwantificering van API’s of inactieve ingrediënten mogelijk maken. CARS wordt meestal gebruikt om structurele huidinformatie af te leiden of chemisch contrast te visualiseren. Daarentegen wordt het SRS-signaal, dat lineair is met moleculaire concentratie, gebruikt om API’s of inactieve ingrediënten binnen huidstratificaties te kwantificeren.
Hoewel muisweefsel vaak is gebruikt voor cPK met CRI, moeten topische BA en bio-equivalentie (BE) uiteindelijk in menselijk weefsel worden beoordeeld voordat de regelgevende goedkeuring plaatsvindt. Dit artikel presenteert een methodologie voor het voorbereiden en in beeld brengen van ex vivo huid voor gebruik in kwantitatieve farmacokinetische CRI-studies bij de evaluatie van topische BA en BE. Deze methodologie maakt betrouwbare en reproduceerbare API-kwantificering mogelijk in de menselijke en muishuid in de loop van de tijd. De concentraties in lipidenrijke en lipidearme compartimenten, evenals de totale API-concentratie in de loop van de tijd worden gekwantificeerd; deze worden gebruikt voor schattingen van BA op micro- en macroschaal en, mogelijk, BE.
Introduction
Methodologieën om cPK te beoordelen na toepassing van topische geneesmiddelen zijn uitgebreid van klassieke in vitro permeatietests (IVPT)studies 1,2,3,4,5 en tape-stripping 6,7,8 tot aanvullende methodologieën zoals open-flow microperfusie of dermale microdialyse 9,10,11, 12,13,14. Er zijn mogelijk verschillende lokale plaatsen van therapeutische actie, afhankelijk van de ziekte van belang. Daarom kan er een overeenkomstig aantal methodologieën zijn om de snelheid en mate te beoordelen waarmee een API op de beoogde lokale actielocatie terechtkomt. Hoewel elk van de bovengenoemde methodologieën zijn voordelen heeft, is het grootste nadeel het gebrek aan cPK-informatie op microschaal (d.w.z. het onvermogen om te visualiseren waar de API naartoe gaat en hoe deze doordringt).
Een niet-invasieve methodologie die van belang is om topische BA en BE te schatten, is CRI, die kan worden onderverdeeld in twee beeldvormingsmodaliteiten: CARS en SRS-microscopie. Deze coherente Raman-methoden maken chemisch specifieke beeldvorming van moleculen mogelijk via niet-lineaire Raman-effecten. In CRI worden twee laserpulstreinen scherpgesteld en gescand in een monster; het verschil in energie tussen de laserfrequenties is ingesteld op trillingsmodi die specifiek zijn voor de chemische structuren van belang. Omdat CRI-processen niet-lineair zijn, wordt een signaal alleen gegenereerd bij de microscoopfocus, waardoor driedimensionale farmacokinetische tomografische beeldvorming van het weefsel mogelijk is. In de context van cPK is CARS gebruikt om weefselstructurele informatie te verkrijgen, zoals de locatie van lipiderijke huidstructuren15. SRS daarentegen is gebruikt om de moleculaire concentratie te kwantificeren, omdat het signaal lineair is met de concentratie. Voor ex vivo huidmonsters is het voordelig om CARS uit te voeren in de epi-richting16 en SRS in transmissiemodus17. Daarom zullen weefselmonsters die dun zijn, SRS-signaaldetectie en kwantificering mogelijk maken.
Als modelweefsel biedt het naakte muisoor verschillende voordelen met kleine nadelen. Een voordeel is dat het weefsel al ~ 200-300 μm dik is en geen verdere monstervoorbereiding vereist. Bovendien worden verschillende huidstratificaties gezien door axiaal te focussen door één gezichtsveld (bijv. stratum corneum, talgklieren (SG’s), adipocyten en onderhuids vet)16,18. Dit maakt een voorlopige preklinische schatting van cutane permeatieroutes en actuele BA-schattingen mogelijk voordat naar menselijke huidmonsters wordt verplaatst. Het naaktmuismodel vertoont echter beperkingen zoals moeilijkheden bij extrapolatie naar in vivo scenario’s als gevolg van verschillen in huidstructuur19. Hoewel het naakte muisoor een uitstekend model is om voorlopige resultaten te verkrijgen, is het menselijke huidmodel de gouden standaard. Hoewel er verschillende commentaren zijn geweest over de geschiktheid en toepasbaarheid van bevroren menselijke huid om in vivo permeatiekinetiek nauwkeurig samen te vatten 20,21,22, is het gebruik van bevroren menselijke huid een geaccepteerde methode voor de evaluatie van in vitro API-permeatiekinetiek 23,24,25 . Dit protocol visualiseert verschillende huidlagen in de muis- en menselijke huid en kwantificeert API-concentraties binnen lipiderijke en lipidearme structuren.
Hoewel CRI op tal van gebieden is gebruikt om specifiek verbindingen in weefsels te visualiseren, zijn er beperkte inspanningen geweest om de cPK van topisch aangebrachte geneesmiddelen te onderzoeken. Om de actuele BA / BE van actuele producten met behulp van CRI te evalueren, is het noodzakelijk om eerst een gestandaardiseerd protocol te hebben om nauwkeurige vergelijkingen te maken. Eerdere inspanningen met behulp van CRI voor medicijnafgifte aan de huid hebben variabiliteit binnen de gegevens aangetoond. Aangezien dit een relatief nieuwe toepassing van CRI is, is het opstellen van een protocol van cruciaal belang om betrouwbare resultaten te verkrijgen 18,26,27. Deze benadering richt zich slechts op één specifiek golfgetal in het biologische stille gebied van het Raman-spectrum. De meeste API’s en inactieve ingrediënten hebben echter Raman-verschuivingen binnen het vingerafdrukgebied. Dit heeft eerder uitdagingen opgeleverd vanwege het inherente signaal dat afkomstig is van het weefsel in het vingerafdrukgebied. Recente laser- en computationele ontwikkelingen hebben deze barrière verwijderd, die ook kan worden gebruikt in combinatie met de hier gepresenteerde aanpak28. Deze hier gepresenteerde aanpak maakt de kwantificering van een API mogelijk, die een Raman-verschuiving heeft in het stille gebied (2.000-2.300 cm-1). Dit is niet beperkt tot de fysiochemische eigenschappen van het geneesmiddel, wat het geval zou kunnen zijn voor sommige eerder genoemde cPK-monitoringmethoden29.
Het protocol moet de variabiliteit van monster tot monster in huiddikte voor verschillende preparaten verminderen, omdat dikke menselijke huidmonsters een minimaal signaal produceren na het aanbrengen van het geneesmiddel als gevolg van lichtverstrooiing door het dikke monster. Een doel van dit manuscript is om een weefselvoorbereidingsmethodologie te presenteren die reproduceerbare beeldvormingsstandaarden garandeert. Bovendien is het CRI-systeem ingesteld zoals beschreven om potentiële foutbronnen te verminderen en signaal-ruis te minimaliseren. Dit artikel zal echter niet ingaan op de leidende principes en technische verdiensten van de CRI-microscoop, omdat dit eerder is behandeld30. Ten slotte wordt de uitgebreide data-analyseprocedure onderzocht om interpretatie van de resultaten mogelijk te maken om het succes of falen van een experiment te bepalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De evaluatie van topische BA/BE is een onderzoeksgebied dat een veelzijdige aanpak vereist, aangezien geen enkele methode in vivo cPK volledig kan karakteriseren. Dit protocol presenteert een methodologie voor de evaluatie van de BA/BE van een topisch geneesmiddel op basis van coherente Raman-beeldvorming. Een van de eerste punten die over het hoofd kan worden gezien, is hoe dun de huidmonsters moeten zijn, vooral voor kwantitatieve transmissie SRS-beeldvorming. Als de huid te dik is (d.w.z. dat licht e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Dr. Fotis Iliopoulos en Daniel Greenfield van de Evans’ Group bedanken voor hun bespreking en proeflezing van dit manuscript. Daarnaast willen de auteurs de steun van LEO Pharma bedanken. Figuur 2 is gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Tissue Preparation | |||
| Autoclavable Biohazard Bags | FisherBrand | 22-044562 | As refered to in text: biohazard bags https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID& matchedCatNo=22044562 |
| Cell Culture Buffers: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x | Corning | MT21030CV | As refered to in text: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv |
| Disposable Scalpels | Exel International | 14-840-00 | As refered to in text: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true |
| High Precision 45° Angle Broad Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-132 | As refered to in text: forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword= |
| Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Kimberly-Clark Professional Kimtech Science | 06-666 | As refered to in text: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666 |
| Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Bemis | 13-374-12 | As refered to in text: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412 |
| Petri Dish (35 mm x 10 mm) | Fisherbrand | FB0875711YZ | As refered to in text: small petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true |
| Petri Dish (60 mm x 15 mm) | Fisherbrand | FB0875713A | As refered to in text: large petri dish https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true |
| Surgical Scissors | Roboz | NC9411473 | As refered to in text: scissors https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID& matchedCatNo=RS-5915SC |
| Laser/microscope | |||
| 650/60 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | As refered to in text: CARS filter – CH2 vibrations (645nm/60nm filter) | |
| Control box IX2-UCB | Olympus | As refered to in text: Control Box | |
| D700/30m | Chroma | As refered to in text: CARS filter – deuterated band https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m |
|
| DeepSee Insight | Spectra-Physics | As refered to in text: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser |
|
| Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console | ThorLabs | PM100D | As refered to in text: power meter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Fluoview Software | Olympus | As refered to in text: Microscope Control software | |
| Frosted Microscope Slides | FisherBrand | As refered to in text: microscope slides https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446 |
|
| FV1000 | Olympus | As refered to in text: Microscope | |
| Incubation Chamber | Tokai Hit | GM-800 | As refered to in text: incubation chamber |
| Integrating Sphere Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S142C | As refered to in text: photodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341 |
| Power supply FV31-PSU | Olympus | As refered to in text: Power Supply | |
| Precision 4063, 80MHz Dual Channel Function Generator | BK Precision | As refered to in text: function generator | |
| ProScan – Precision Microscope Automation | Prior Scientific Instruments | As refered to in text: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation |
|
| SecureSeal Imaging Spacers | Grace Biolabs | 654004 | As refered to in text: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/ |
| SRS Detection Kit | APE | As refered to in text: SRS detector | |
| UPLSAPO 20X NA:0.75 | Olympus | As refered to in text: 20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/ |
|
| Lipid/Drug Imaging | |||
| 35 mm Dish, No. 0 Uncoated Coverslip, 14 mm Glass Diameter | MatTek Corporation | NC9711297 | As refered to in text: Glass bottom dish https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297 |
| Cotton-tipped applicators | FisherBrand | As refered to in text: Cotton-tipped applicator | |
| Distriman Postive Displacement Pipette | Gilson | As refered to in text: Postive Displacement Pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword= |
|
| Distriman Postive Displacement Pipette Tips | Gilson | As refered to in text: Tips for pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true |
|
| Data Analysis | |||
| FIJI | Open-source | As refered to in text: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ |
|
| Jupyter-Lab | open-source | As refered to in text: JupyterLab https://jupyter.org/ |
|
| Rstudio | Open-source | As refered to in text: Rstudio https://www.rstudio.com/ |
References
- Finnin, B., Walters, K. A., Franz, T. J., Benson, H. E., Watkinson, A. C. In vitro skin permeation methodology. In Transdermal and topical drug delivery: principles and methodology. Transdermal and topical drug delivery: principles and practice. , 85-108 (2012).
- Shin, S. H., et al. On the road to development of an in vitro permeation test (IVPT) model to compare heat effects on transdermal delivery systems: exploratory studies with nicotine and fentanyl. Pharmaceutical Research. 34 (9), 1817-1830 (2017).
- Hossain, A., et al. Preparation, characterisation, and topical delivery of terbinafine. Pharmaceutics. 11 (10), 548 (2019).
- Santos, L. L., Swofford, N. J., Santiago, B. G. In vitro permeation test (IVPT) for pharmacokinetic assessment of topical dermatological formulations. Current Protocols in Pharmacology. 91 (1), 79 (2020).
- Iliopoulos, F., Caspers, P. J., Puppels, G. J., Lane, M. E. Franz cell diffusion testing andquantitative confocal Raman spectroscopy: In vitro-in vivo correlation. Pharmaceutics. 12 (9), 887 (2020).
- Cordery, S., et al. Topical bioavailability of diclofenac from locally-acting, dermatological formulations. International Journal of Pharmaceutics. 529 (1-2), 55-64 (2017).
- Pensado, A., et al. Stratum corneum sampling to assess bioequivalence between topicalacyclovir products. Pharmaceutical Research. 36 (12), 1-16 (2019).
- Zhang, Y., et al. Dermal delivery of niacinamide-in vivo studies. Pharmaceutics. 13 (5), 726 (2021).
- Bodenlenz, M., et al. Open flow microperfusion as a dermal pharmacokinetic approach to evaluate topical bioequivalence. Clinical Pharmacokinetics. 56 (1), 91-98 (2017).
- Eirefelt, S., et al. Evaluating dermal pharmacokinetics and pharmacodymanic effect of soft topical PDE4 inhibitors:Open flow microperfusion and skin biopsies. Pharmaceutical Research. 37 (12), 1-12 (2020).
- Stagni, G., O’Donnell, D., Liu, Y. J., Kellogg, J. D. L., Shepherd, A. M. Iontophoretic current and intradermal microdialysis recovery in humans. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 49-54 (1999).
- Garcia Ortiz, P., Hansen, S. H., Shah, V. P., Menne, T., Benfeldt, E. Impact of adultatopic dermatitis on topical drug penetration: assessment by cutaneous microdialysis and tape stripping. Acta Dermato-Venereologica. 89 (1), 33-38 (2009).
- Joshi, A., Patel, H., Joshi, A., Stagni, G. Pharmacokinetic applications of cutaneous microdialysis: Continuous+intermittent vs continuous-only sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 83, 16-20 (2017).
- Kuzma, B. A., et al. Evaluation of local bioavailability of metronidazole from topical formulations using dermal microdialysis: Preliminary study in a Yucatan mini-pig model. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 159, 105741 (2021).
- Begley, R., Harvey, A., Byer, R. L.Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy. Applied Physics Letters. 25 (7), 387-390 (1974).
- Evans, C. L., et al. Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807-16812 (2005).
- Hill, A. H., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
- Feizpour, A., Marstrand, T., Bastholm, L., Eirefelt, S., Evans, C. L. Label-free quantification of pharmacokinetics in skin with stimulated Raman scattering microscopy and deep learning. Journal of Investigative Dermatology. 141 (2), 395-403 (2021).
- Ghosh, B., Reddy, L. H., Kulkarni, R. V., Khanam, J. Comparison of skin permeability of drugs in mice and human cadaver skin. Indian Journal of Experimental Biology. 38 (1), 42-45 (2000).
- Nielsen, J. B., Plasencia, I., Sørensen, J. A., Bagatolli, L. Storage conditions of skin affect tissue structure and subsequent in vitro percutaneous penetration. Skin Pharmacology and Physiology. 24 (2), 93-102 (2011).
- Barbero, A. M., Frasch, H. F. Effect of frozen human epidermis storage duration and cryoprotectant on barrier function using two model compounds. Skin Pharmacology and Physiology. 29 (1), 31-40 (2016).
- Babu, R., et al. The influence of various methods of cold storage of skin on the permeation of melatonin and nimesulide. Journal of Controlled Release. 86 (1), 49-57 (2003).
- Skelly, J. P., et al. FDA and AAPS report of the workshop on principles and practices of in vitro percutaneous penetration studies: relevance to bioavailability and bioequivalence. Pharmaceutical Research. 4 (3), 265-267 (1987).
- OECD. Guidance document for the conduct of skin absorption studies. OECD. , (2004).
- OECD. Test no. 428: Skin absorption: In vitro method. OECD. , (2004).
- Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging drug delivery to skin with stimulated Raman scattering microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-windowsparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
- Herkenne, C., et al. In vivo methods for the assessment of topical drug bioavailability. Pharmaceutical Research. 25 (1), 87-103 (2008).
- Alfonso-Garcıa, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Osseiran, S., et al. Longitudinal monitoring of cancer cell subpopulations in monolayers, 3D spheroids, and xenografts using the photoconvertible dye DiR. Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).
- Evennett, P. Kohler illumination: a simple interpretation. Proceedings of the Royal Microscopical Society. 28 (4), 189-192 (1983).
- Sanderson, J. Fundamentals of microscopy. Current Protocols in Mouse Biology. 10 (2), 76 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hunter, J. D. Matplotlib: A 2D graphics environment. Computing in Science & Engineering. 9 (3), 90-95 (2007).
- Wickham, H. . ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , (2016).
- Kim, H., Han, S., Cho, Y. S., Yoon, S. K., Bae, K. Development of R packages:’Non-Compart’ and ‘ncar’ for noncompartmental analysis (NCA). Translational and Clinical Pharmacology. 26 (1), 10-15 (2018).
