돼지 말초 혈액에서 혈액 성장 내피 세포(BOEC)의 특성화
Abstract
내피는 혈관신생, 지혈, 염증 및 항상성과 같은 많은 생리적 기능에서 중요한 역할을 하는 역동적인 통합 구조입니다. 내피는 또한 죽상동맥경화증, 고혈압 및 당뇨병과 같은 병태생리학에서 중요한 역할을 합니다. 내피 세포는 혈액과 림프관의 내벽을 형성하고 구조와 기능면에서 이질성을 나타냅니다. 다양한 그룹은 조혈 줄기 세포 또는 성숙한 혈액 파생 내피 세포(또는 내피 집락 형성 세포)에서 유래한 내피 전구 세포에 초점을 맞춰 인간 말초 혈액에서 유래한 내피 세포의 기능을 평가했습니다. 이 세포는 치료 및 질병 모델링을 위한 자가 자원을 제공합니다. 이종 세포는 유사한 조건에서 자란 유전적으로 유사한 동물을 사용하여 달성된 가용성 및 균질성으로 인해 대체 치료제 공급원을 제공할 수 있습니다. 따라서, 돼지 말초 혈액으로부터 고도로 증식하는 혈액 유출 내피 세포의 분리 및 확장을 위한 강력한 프로토콜이 제시되었다. 이 세포는 심혈관 조직 공학, 세포 치료, 질병 모델링, 약물 스크리닝, 내피 세포 생물학 연구, 이종 이식에서 염증 및 응고 반응을 조사하기 위한 시험관 내 공동 배양과 같은 다양한 응용 분야에 사용할 수 있습니다.
Introduction
내피는 매우 복잡하고 역동적인 구조이며 혈관벽의 중요한 구성 요소입니다. 순환하는 혈액과 주변 조직 사이에 물리적 인터페이스를 제공하기 위해 혈관의 내부 표면을 감싸고 있습니다. 이러한 이질적인 구조는 혈관신생, 염증, 혈관조절, 지혈등의 다양한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다 1,2,3,4. 인간 제대 정맥 내피 세포는 내피 세포의 기능을 평가하기 위해 널리 연구된 세포 유형입니다. 그러나, 환자별 배치 가변성, 일관되지 않은 표현형 및 최소 분할 효율은 이러한 모든 특징을 개선할 수 있는 세포 공급원을 결정할 필요가 있음을 시사한다5.
일차 내피 세포의 균질한 집단을 얻는 것은 기술적으로 어려울 수 있으며, 일차 내피 세포는 높은 증식 능력을 갖지 않는다6. 따라서 혈관 재생을 연구하고 병태생리학적 과정을 평가하기 위해 다양한 그룹이 말초 혈액에서 파생된 다양한 유형의 내피 세포, 예를 들어 내피 전구 세포(EPC) 또는 혈액 성장 내피 세포(BOEC)를 얻고 평가하려고 시도했습니다.6,7,8,9 . 방추형 초기 EPC는 조혈 줄기 세포(HSC)에서 유래하며 성장 효능이 제한적이고 성숙한 내피 세포를 생성하는 혈관 신생 능력이 제한적입니다. 또한, 그들은 염증성 단핵구와 매우 유사합니다. 또한, 기능적이고, 증식하고, 성숙한 내피 세포로 더 분화하는 능력은 여전히 논란의 여지가 있다 6,7,9,10. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 연속 배양은 후기 성장 EPC, BOEC 또는 내피 콜로니 형성 세포 (ECFC)로 알려진 세포의 2 차 집단을 생성 할 수 있습니다 6,7,9,10. Medina et al. 2018년에 EPC의 한계, 명명법의 모호성, EPC11에 따라 지속적으로 그룹화되는 많은 별개의 세포 유형과의 일반적인 일치 부족을 인정했습니다. 대조적으로, BOEC는 혈관 복구, 건강 및 질병, 세포 치료에서 그 역할로 인정 받고 있습니다. 이들 세포의 추가 연구 및 치료적 사용은 순환 전구 세포로부터 이러한 세포 유형을 일관되게 유도하기 위한 프로토콜에 의존할 것이다.
BOECs와 같은 일차 세포는 증식성이 높은 성숙한 내피 세포6를 얻기 위한 대용물로서 사용될 수 있다. BOEC는 초기 EPC와 표현형적으로 구별되며 조약돌 형태 및 부착 접합부 및 카베올라 발현과 같은 전형적인 내피 특징을 나타냅니다12. Hebbel et al.13,14,15에 의한 유전자 프로파일링은 BOEC 또는 ECFC가 미세혈관 및 대혈관 형성을 촉진하기 때문에 진정한 내피 세포임을 발견했습니다. 따라서 BOEC는 병태생리학적 과정과 유전적 변이를 평가하는 도구로 사용될 수 있다16. 이들은 또한 혈관 재생을 위한 세포 치료를 위한 우수한 세포 공급원으로 간주된다17. 따라서 이러한 고증식 세포를 일관되게 유도하기 위한 표준화된 프로토콜이 필수적입니다.
BOEC는 인간의 병태생리학적 및 유전적 변이를 연구하기 위한 강력한 도구를 제공하지만, 보다 균질한 BOEC 공급원은 보다 강력하고 신뢰할 수 있는 실험 및 치료 결과를 제공할 수 있습니다. 우수한 균질성은 유사한 조건에서 자란 유전적으로 유사한 동물로부터 유래된 이종유전 세포 공급원을 사용함으로써 달성될 수 있다18. 이종 세포 공급원은 숙주 면역 반응을 유도하는 경향이 있지만, 면역 적합성 동물 및 세포를 포함한 동물 제품을 생성하는 것을 목표로 면역 조절 전략이 개발되고 있습니다. 특히 돼지는 말초 혈액의 풍부한 공급원이며 인간과의 해부학적 및 생리학적 유사성으로 인해 의료 기기 및 기타 치료법을 연구하는 데 일반적으로 사용됩니다. 따라서 이 연구는 돼지 말초 혈액에서 고증식성 BOEC의 분리 및 확장을 위한 프로토콜을 개선합니다. 아래에 자세히 설명된 프로토콜은 비교적 적은 양의 혈액에서 많은 수의 BOEC를 얻는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 배양은 단일 혈액 샘플에서 수백만 개의 세포를 생성하기 위해 여러 계대를 통해 확장될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
BOEC는 다양한 과학적 및 치료적 접근법에 사용될 수 있는 강력한 도구이다 7,8,16. BOEC는 혈관 질환 및 암의 발병을 담당하는 주요 인자를 밝히기 위해 EC 유전자 발현을 분석하는 데 사용되어 왔다 5,19,20,21. BOEC는 또한 혈관 재생 및 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 NIH/NHLBI R00 HL129068의 자금 지원을 인정하고자 합니다.
Materials
| 19 G needle | Covidien | 1188818112 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 352098 | |
| 6 well plate | BD Falcon | 353046 | |
| 60 mL syringes | Covidien | 8881560125 | |
| Ammonium chloride solution (0.8%) | Stemcell Technologies | 07850 | |
| Antibiotic/antimycotic solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-253-839 | |
| EGM-2 culture medium | Lonza Walkersville | CC-3162 | |
| Extension tube | Hanna Pharmaceutical Supply Co. | 03382C6227 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas Biologicals | F-0500-A | |
| Ficoll-Paque 1077 | Cytiva | 17144003 | Density gradient solution |
| Heparin sodium injection (1,000 units/mL) | Pfizer | 00069-0058-01 | |
| Human plasma fibronectin | Gibco | 33016-015 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Pipette set | Eppendorf | 2231300004 | |
| Sterile water | Gibco | 15230-162 | |
| Thin pipette | Celltreat Scientific | 229280 |
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